Überprüfung neuronaler Rezeptoren bei parasitischen Nematoden und Caenorhabditis elegans auf ihre Beteiligung an anthelminthischen Wirkmechanismen

Abstract

Auf Grund der wachsenden Resistenzproblematik bei der Bekämpfung von parasitischen Nematoden ist die Entdeckung neuer Wirkstoffe, die Aufklärung ihrer Wirkmechanismen und die Identifikation möglicher Wechselwirkungen von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des γ Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptors unc-49 im Wirkmechanismus des Anthelminthikums Emodepsid anhand von Caenorhabditis elegans Bewegungs- und Entwicklungsassays gezeigt werden. Die getesteten GABAA-Rezeptor unc-49 "loss of function" C. elegans Stämme erwiesen sich in den durchgeführten Assays als signifikant geringer empfindlich gegenüber der Wirkung von Emodepsid als der Wildtyp. Dies wurde durch ein "rescue" Experiment überprüft, für welches die unc 49B cDNA des zoonotischen Ascariden Toxocara canis vollständig identifiziert wurde. Die T. canis unc 49B cDNA wurde in ein Expressions- Plasmid gemeinsam mit dem UNC-49 C. elegans Promotor und einer C. elegans 3' UTR eingebaut und in die Gonaden der GABAA-Rezeptor unc-49 "loss of function" C. elegans Stämme injiziert. Auf diese Weise konnte der Wildtyp Phänotyp wieder hergestellt werden. Außerdem konnte noch eine verminderte Emodepsidempfindlichkeit bei C. elegans Mutanten, denen die Acetylcholin Rezeptoruntereinheiten lev-1 und unc-38 fehlten, festgestellt werden. Desweiteren wurden die Wirkmechanismen der anthelminthischen Wirkstoffe Piperazin, Tribendimidin und HLR-9291 anhand von C. elegans Assays überprüft und Wechselwirkungen mit Emodepsid, sowie das Vorkommen von "negative cross resistance" untersucht. Es konnte für Piperazin weder eine Beteiligung des GABAA Rezeptors unc-49 noch eine Beteiligung der untersuchten Acetylcholin Rezeptoruntereinheiten lev-1, lev-8, unc-38 und unc-63 am Piperazinwirkmechanismus festgestellt werden, obwohl es dafür Hinweise aus früheren Studien gab. Die Beteiligung der Acetylcholin-Rezeptoruntereinheiten lev-1, lev-8, unc-38 und unc-63 am Tribendimidinwirkmechanismus konnte dagegen bestätigt werden, denn lev-1, lev-8, unc-38 und unc-63 "loss of function" C. elegans Stämme zeigten sich im C. elegans Entwicklungsassay als resistent gegen Tribendimidin. Dem Tribendimidinderivat HLR-9291 liegt vermutlich der selbe Wirkmechanismus zu Grunde wie Tribendimidin. Auch hier sind die lev-1, lev-8, unc-38 und unc-63 "loss of function" C. elegans Stämme vollständig unempfindlich gegenüber HLR-9291. Allerdings ist die Wirkung von HLR-9291 deutlich schwächer als die Wirkung von Tribendimidin. Es wurden mögliche Wechselwirkungen zwischen Emodepsid, Tribendimidin und HLR-9291 überprüft und dabei festgestellt, dass es keinen Synergismus zwischen den Substanzen gibt. Allerdings konnte in mehreren Fällen das Auftreten von "negative cross resistance" festgestellt werden. Die Emodepsid-resistente Mutante slo-1 js379 zeigte sich deutlich empfindlicher als der Wildtyp bei Behandlung mit Piperazin und Tribendimidin bzw. HLR-9291. Die geringer Emodepsid- empfindlichen GABAA-Rezeptor unc-49 "loss of function" C. elegans Stämme waren ebenfalls sensibler als der Wildtyp bei Behandlung mit Tribendimidin und HLR-9291. Dies lässt darauf schließen, dass "negative cross resistance" ein bei Nematoden oft vorkommendes Ereignis ist und näher untersucht werden sollte. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zur Aufklärung der Wirkmechanismen der anthelminthischen Wirkstoffe Emodepsid, Piperazin, Tribendimidin und HLR-9291 und liefert außerdem wichtige Erkenntnisse und neue Ansatzpunkte für zukünftige Forschungen im Bereich der anthelminthischen Wechselwirkungen.

Due to the growing resistance problem in the control of parasitic nematodes the discovery of new drugs, the elucidation of their mechanisms of action and the identification of possible anthelmintic interactions are very important. In this research work the involvement of the γ-aminobutyric acid (GABA) receptor unc-49 in the mechanism of action of the anthelmintic emodepside was shown in Caenorhabditis elegans movement and development assays. In these assays the tested GABAA receptor unc-49 loss of function C. elegans strains were found to be significantly less susceptible to emodepside than the wildtype. The Toxocara canis unc 49B cDNA sequence was completely identified and used in a rescue experiment. The T. canis unc-49B cDNA was inserted into a plasmid together with the C. elegans UNC-49 promoter and a C. elegans 3' UTR. This plasmid was injected in the gonads of the GABAA receptor unc-49 loss of function C. elegans strains. Using this approach the wild-type phenotype was successfully restored. Interestingly, there was a lower susceptibility against emodepside in C. elegans mutants which have lost the acetylcholine receptor subunit lev-1 and unc-38. Furthermore, the mechanisms of action of the anthelmintic drugs piperazine, tribendimidine and HLR-9291 were examined using C. elegans the above mentioned assay. Possible interactions between emodepside and other anthelminthic substances were investigated as well as the presence of negative-cross-resistance. In contrast to evidence from previous studies, the current study did not indicate an involvement of the GABAA receptor unc-49 or the acetylcholine receptor subunit lev 1, lev-8, unc-38 and unc-63 in the mechanism of action of piperazine. However, lev-1 lev 8, unc-38 and unc-63 loss of function C. elegans strains were shown to be resistant to tribendimidine in the C. elegans development assay, therefore confirming the involvement of those acetylcholine receptor subunits in the mechanism of action of tribendimidine. The tribendimidine derivative HLR-9291 has obviously the same mechanism of action as tribendimidine since the lev-1 lev-8, unc-38 and unc-63 loss of function C. elegans strains were completely resistant to HLR-9291. However, the effect of HLR-9291 was significantly weaker than the effect of tribendimidine. Possible interactions between emodepside, tribendimidine and HLR-9291 were examined and no synergism between the substances was found. However, it was shown that negative cross resistance occurs often. The emodepside resistant mutant slo-1 js379 was significantly more susceptible than the wildtype when treated with piperazine, tribendimidine or HLR-9291. The GABAA receptor unc-49 loss of function mutants with reduced susceptibility to emodepside were also significantly more ssusceptible than the wildtype when treated with tribendimidine or HLR-9291.This suggests that "negative cross resistance" is an often occurring event in nematodes and should be further investigated. This work contributes to the elucidation of the mechanisms of action of the anthelmintic drugs emodepside, piperazine, tribendimidine and HLR 9291 and also provides important insights and new approaches for future research in the field of anthelminthic interactions.