Die Klonierung und Charakterisierung des protein kinase A anchoring protein r(rat)Ht31 aus der Rattenniere

Abstract

Bei dem Screening einer Rattennieren-cDNA-Bibliothek zur Identifizierung von protein kinase A anchoring proteins (AKAPs), die potentiell an der Vasopressin-vermittelten Wasserrückresorption im Sammelrohr der Niere beteiligt sind, wurde der Partialklon 2.1 isoliert. Es handelt sich um das Rattenorthologe (rHt31 1-576) des humanen AKAP hHt31, dessen vollständige cDNA-Sequenz bisher noch nicht ermittelt wurde (Carr et al. 1992a). Die der klassischen RII-Bindungsdomäne von hHt31 entsprechende Bindungsdomäne von rHt31 befindet sich im Bereich der Aminosäuren 65-78. Eine zweite, niedrig affine RII-Bindungsdomäne befindet sich im Bereich der Aminosäuren 470-576. Durch eine Kombination von Datenbankanalysen und RACE-PCR konnte die publizierte cDNA-Sequenz von hHt31 (3045 bp) experimentell um insgesamt 5287 bp verlängert werden. Diese Sequenz enthält die Basenpaare 10-4290 des humanen breast cancer nuclear receptor-binding auxillary protein (hBrx) und des lbc (lymphoid blast crisis)-Protoonkogens Proto-Lbc. Bei diesen zur Familie der Dbl-Onkogene gehörenden Proteinen hBrx und Proto-Lbc, dessen Sequenz dem C-Terminus von hBrx entspricht, handelt es sich daher um kürzere Spleißvarianten von hHt31. Das hHt31-Gen befindet sich auf dem Chromosom 15, inzwischen konntest die Sequenz des Nach Abschluß der experimentellen Arbeiten konnte auch der Translationsstart von hHt31 ermittelt werden, dieser liegt 110 bp vor dem 5`-Ende dereigtIn dieser 8332 bp-langen Sequenz ist der Translationsstart noch nicht enthalten. Die Basenpaare 1-2149 zeigen keine Homologie zu bekannten Sequenzen in der Datenbank, Basenpaare 2150-5194 entsprechen der publizierten Sequenz von hHt31. Basenpaare 4052-8332 sind mit der Sequenz des humanen breast cancer nuclear receptor-binding auxillary protein (hBrx 10-4290) identisch. Bei den zur Familie der Dbl-Onkogene gehörenden Proteinen hBrx und Proto-Lbc, dessen Sequenz dem C-Terminus von hBrx entspricht, handelt es sich daher um kürzere Spleißvarianten von hHt31. Alle drei Proteine (hHt31, hBrx und Proto-Lbc) werden von einem Gen auf Chromosom 15 kodiert, welches 38 Exons enthält. Mit einem Antikörper, der sowohl rHt31/hHt31 als auch hBrx erkennt, wurden in verschiedenen Geweben und Zellinien immunreaktive Proteine unterschiedlicher Größe detektiert. Dies deutet auf die Existenz weiterer Spleißvarianten hin. Immunreaktive Proteine wurden sowohl in den löslichen Zellfraktionen als auch in den partikulären und in den Kernfraktionen nachgewiesen. In den Brustkrebszellinien ZR-75-1 und MCF-7 wurde in allen Fraktionen ein immunreaktives Protein im hochmolekularen Bereich (ca. 300-400 kDa) detektiert, bei dem es sich wahrscheinlich um hHt31 handelt. Die Existenz einer aufgrund der Sequenz postulierten RII- Bindungsdomäne in hBrx konnte für die Deletionsmutante hBrx 84-378 experimentell nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings hat ein ca. 170 kDa-Protein in der partikulären Fraktion der ZR?75?1-Zellen, bei dem es sich wahrscheinlich um hBrx handelt, im RII-overlay die RII-Untereinheiten gebunden. Sowohl hHt31 als auch bei Nachweis einer RI/RII-Bindungsdomäne die kürzere Spleißvariante hBrx können zu den multifunktionellen Adaptorproteinen gezählt werden, welche über verschiedene Effektoren eine Vielzahl transmembranäre und intrazelluläre Signaltransduktionsprozesse regulieren.

In an attempt to isolate protein kinase A anchoring proteins (AKAPs) involved in vasopressin-mediated water reabsorption a partial cDNA clone with an open reading frame of 582 amino acids (rHt31 (GenBank accession number AF387102) and 67,7 % identity to the human AKAP hHt31 was isolated. One RII binding site was mapped to amino acid residues 65-78; a second binding site with lower RII affinity was mapped to amino acid residues 470-576. The complete cDNA sequence of hHt31 was determined by a combination of RACE-PCR experiments and data base analysis. The hHt31 cDNA includes the estrogen receptor cofactor hBrx and the RhoA GDP/GTP exchange factor proto lymphoid blast crisis (Lbc) sequences. The human Ht31 gene was assigned to chromosome 15 (region q24-25). It consists of 36 exons and encodes hHt31 and the smaller splice variants hBrx and proto-Lbc. A rHt31-specific probe detected in heart, skeletal muscle and renal inner medulla mRNA transcripts of 9 kb and > 9.5 kb. The mRNA species of > 9.5 kb may encode the rHt31 protein. An antibody directed against a common epitope in rHt31, hHt31 and hBrx detects in the human mammary carcinoma cell lines ZR75-1 and MCF7 a protein of about 300-400 kDa, which may represent the full length Ht31 protein. In various human tissues and cell lines the antibody detected several proteins (60 - > 200 kDa) in the soluble and particulate fractions, indicating the presence of multiple splice variants in different subcellular fractions. Ht31 and its splice variants may represent a new type of multivalent scaffold proteins, which may regulate various signal transduction pathways.