Erste Untersuchungen zu Vorkommen und Zusammensetzung von Biofilmen bei Hunden, Katzen und Pferden mit chronischen Wundnahtinfektionen

Abstract

In der Medizin stellen resistente Bakterien bei der Behandlung von chronischen, infizierten Wunden zunehmend ein Problem dar. Dies ist in unterschiedlichen Resistenzmechanismen begründet, die Bakterien zu ihrem Schutz entwickelt haben. Als Gemeinschaft können Bakterien durch die Ausbildung einer extrazellulären, polymeren Matrix (EMP) einen Biofilm bilden, der eine Barriere für viele antimikrobielle Faktoren, einschließlich der traditionellen, antibiotischen Therapie bakterieller Infektionen, darstellt. Insbesondere das Einbringen von Nahtmaterial und chirurgischem Material wie Implantaten bietet den Bakterien eine Grenzfläche, die als Ausgangspunkt für die Besiedelung und für die Entwicklung eines Biofilms genutzt werden kann. Der erste Teil der Untersuchung war eine retrospektive Studie zur Abschätzung der Inzidenz von Biofilmen bei ausgewählten Tierarten aus dem Archivmaterial des Instituts für Tierpathologie der Freien Universität Berlin. Untersucht wurden 91 Proben. Hierbei stammten 68 von Hunden, 15 von Katzen und acht von Pferden. Dreiundfünfzig dieser 91 Proben waren Haut, Mukosa oder Milchdrüse, 28 stammten vom Urogenitaltrakt, drei Proben enthielten Skelettmuskulatur und sieben Proben Darmgewebe. Mittels einer Kombination verschiedener pathohistologischer Färbungen konnten die Bestandteile eines Biofilms, also die Bakterien, eine Grenzfläche sowie eine Matrix, im Lichtmikroskop veranschaulicht werden. Eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) wurde angewendet, um die Grenzfläche zwischen dem Nahtmaterial und dem Gewebe darzustellen. Mittels einer Gram- bzw. einer Giemsa-Färbung konnten Bakterien bzw. ihre Desoxyribonukleinsäure (DNA) gezeigt werden. Eine Periodic-Acid-Schiff- Reaktion (PAS) zeigte die von den Bakterien gebildete EPM. Die Auswertung zeigte eine Biofilmbildung in zwei von 91 Proben. Die beiden Proben mit den detektierten Biofilmen enthielten jeweils polyfile Nahtmaterialien und stammten von Hunden. Eine dieser Proben stammte aus einer Hautwunde und zeigte eine hochgradige, chronisch-aktive, eitrige und granulomatöse Entzündung. Die zweite Probe, ein Uterusstumpf aus einer Ovariohysterektomie, wies eine hochgradige, chronisch-aktive, lymphoplasmazelluläre und granulomatöse Entzündung auf. Die Literatur zu Biofilmen, die weitgehend aus der Humanmedizin stammt, beschreibt eine meist weit höhere Inzidenz von Biofilmen. Diese Unterschiede der Inzidenz von Biofilmen können verschiedene Ursachen haben. Zum einen gibt es in der Literatur Hinweise darauf, dass das Potential zur Biofilmbildung von animalen Bakterien geringer ist als das von humanen Keimen. Zum anderen fehlen die Daten zu prä- und postoperativer Antibiotikatherapie, zu Operationsverfahren und zum Hygienemanagement bei den Eingriffen. Da diese Faktoren nachweislich einen Einfluss auf die Infektionsrate bei dem Einsetzen von Fremdmaterial haben, erschwert das Fehlen der Daten die Interpretation der Ergebnisse der Studie. Ein weiteres Problem ist das Fehlen eines Goldstandards zum Nachweis von Biofilmen. Dies führt dazu, dass die Studien untereinander schlecht vergleichbar sind. Der zweite Teil dieser Studie diente der Identifizierung der Bakterien in Biofilmen mittels Next Generation Genome Sequencing (NGGS). Im Anschluss an die Auswahl der Proben und die DNA-Isolierung wurde das Verfahren freundlicherweise von Herrn Dr. Dirk Höper des Friedrich-Loeffler-Institut auf der Insel Riems durchgeführt. Zwei der drei Proben hierfür waren die biofilmpositiven Proben der ersten Studie, eine weitere konnte aus einer Kooperationsstudie gewonnen werden. Diese stammte ebenfalls von einem Hund und enthielt polyfiles Nahtmaterial einer Operationswunde der Haut. Die Auswertung identifizierte teils in der Literatur als typische Krankheitserreger beschriebene Bakterien wie Enterobacteriaceae, aber auch Bakterien, deren Auftreten in Wundinfektionen bisher noch nicht beschrieben wurden, wie die Deinococcaceae. Die Proben untereinander überschnitten sich teilweise bei bakteriellen Familien, zeigten aber auch unterschiedliche Familien auf. Die überlappenden Familien aller drei Biofilme waren Fusobacteriaceae und Porphyromonadaceae. Die drei häufigsten Familien des ersten untersuchten Biofilms waren Porphyromonadaceae, Fusobacteriaceae und Peptostreptococcaceae, des zweiten Biofilms Deinococcaceae, Methylobacteriaceae und Nocardiaceae und des dritten Biofilms Porphyromonadaceae, Alteromonadaceae und Fusobacteriaceae. Das NGGS- Verfahren bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden für eine retrospektive Studie. So können Proben aus formalinfixiertem und paraffineingebettetem Material eingesetzt werden und es ist nur ein sehr geringes Probenvolumen nötig. Ein weiterer Vorteil ist die vollständige Zuordnung von DNA-Sequenzen zu bakteriellen Familien bzw. Spezies durch den Abgleich mit einer Datenbank. Allerdings handelt es sich um ein methodisch aufwändiges Verfahren, welches hohe Spezialkompetenzen für die Auswertung voraussetzt. Außerdem liefert das Verfahren keine Informationen über die Vitalität der detektierten Bakterien und der Kausalität zwischen diesen Bakterien und der Biofilmentstehung. Um eine Vergleichbarkeit von Studien zu erhalten, sollten zukünftig einheitliche Verfahren zum Nachweis von Biofilmen und zur Identifikation darin enthaltener Bakterien eingeführt werden. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass (1.) Biofilme tatsächlich bei Wundinfektionen mit Nahtmaterial bei Tieren vorkommen, (2.) die Inzidenz von Biofilmen geringer sein könnte als für den Menschen beschrieben und (3.) die detektierten Bakterienfamilien überraschend zahlreich und abweichend zwischen den Proben und zu den Ergebnissen früherer Studien beim Menschen waren.

Resistant bacteria are an increasing problem for the medical treatment of chronically infected wounds. This is caused by resistance mechanisms bacteria developed for their protection. Living as a community, bacteria are able to develop biofilms which are composed of bacteria and an extracellular polymeric matrix (EMP). Those biofilms work as a barrier against antimicrobial factors including traditional antibiotic therapy of bacterial infections. Especially suture material and medical devices such as implants constitute an interface for bacterial colonization and the development of biofilms. The first part of the study was a retrospective investigation of archive material from the Department of Veterinary Pathology, Freie Universität Berlin, to assess the incidence of biofilms. Ninety-one samples were analyzed. Sixty-eight of them originated from dogs, 15 from cats, and eight from horses. Fifty-three tissue samples were collected from skin, mucosa, or mammary gland. Three originated from skeletal muscle, seven from intestine and 28 from urogenital tract. By using a combination of different histopathological stains, the components of a biofilm could be visualized so that bacteria, interface and matrix could be detected under the light microscope. A hematoxylin and eosin staining (HE) was used to identify the interface between the suture material and the tissue. A periodic-acid-Schiff reaction (PAS) was used to visualize the EMP. Giemsa and Gram stains identified nucleic acid or Gram-positive bacterial organisms, respectively, in the EPM. The investigation identified biofilms in two of 91 samples. Both positive samples included polyfilic suture material from dog tissue. The first one was a biopsy from a skin wound and showed a severe chronic-active suppurative and granulomatous inflammation. The second one was a fragment of an ovariohysterectomized uterus stump associated with a severe chronic-active lymphoplasmacytic and granulomatous inflammation. The literature on the subject of biofilms is dominated by human medicine studies and describes a much higher incidence than shown in this investigation. These differences might be caused by the following reasons: First, there are hints in the literature that the potential for biofilm-building of animal bacterial is lower than of human bacteria; second, the data regarding pre- and postoperative antimicrobial treatment, surgical methods and hygienic management during the surgeries are incomplete. Because these factors have probably influenced the infection rate during the implantation of foreign body material, it is difficult to comp these results with recent investigations of human tissues. A further problem is the lack of a gold standard for biofilm detection which makes it even more difficult to compare the results. The second part of the study consisted of the identification of bacterial in the biofilms by means of Next Generation Genome Sequencing (NGGS). Subsequent to the selection of samples and the DNA isolation this was realized by Dr. Dirk Höper, Friedrich-Loeffler-Institute, Island Riems. In total, three samples underwent NGGS. Two of them were taken from the first part of the study while the third one was included from a different project. The third sample was also dog tissue and it also contained polyfilic suture in a surgical wound of the skin. The genetic analysis identified typical biofilm-associated bacteria like Enterobacteriaceae as well as bacteria like Deinococcaceae which have not been identified in infected wounds so far. The three samples showed overlapping results of bacterial families but they also had differences in their composition. Overlapping bacterial families in all of the three samples were Fusobacteriaceae and Porphyromonadaceae. The three most prominent families in the first analysed biofilm were Porphyromonadaceae, Fusobacteriaceae and Peptostreptococcaceae, in the second biofilm Deinococcaceae, Methylobacteriaceae and Nocardiaceae and in the third sample Porphyromonadaceae, Alteromonadaceae and Fusobacteriaceae. The NGGS-analysis has advantages over other methods used for retrospective studies. In this method it is possible to use formalin fixed and paraffin embedded material and a small sample quantity is sufficient. A further advantage is the clear assignment of DNA sequences to bacterial families and species based on a database matching. However, it is a sophisticated method with complicated procedures and special knowledge to evaluate the data is necessary. Furthermore, the method provides no information about the vitality of the detected bacteria and the causality among these bacteria and the biofilm formation. Summarizing the results of this study, it could be shown that (1.) biofilms occur in infected wounds associated with suture material in animals, (2.) the incidence of biofilms seems to be lower than reported in human medicine, and (3.) the number of detected bacterial families was surprisingly high and there were differences among the samples and to the results generated in previous studies.