Frühe Vorhersage akuter und chronischer Abstoßung nach Dünndarmtransplantation in Tacrolimus behandelten Ratten

Abstract

Heutzutage ist die einzige kausale Therapie des Kurzdarmsyndroms beziehungsweise des funktionellen intestinalen Versagens eine Dünndarmtransplantation. Es gibt jedoch keine etablierten nichtinvasiven Biomarker zur frühzeitigen Beurteilung einer möglichen Organabstoßung. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, das diagnostische Potential von sieben Biomarkern (CD3, Perforin, TOAG-1, α-1,2-Mannosidase, LBP, B-Zell-IgG und Alloantikörper), die sowohl aus peripheren Blutleukozyten als auch aus Organproben isoliert wurden, zu bestimmen. Hierzu wurde in einem tierexperimentellen Modell eine orthotope DDTx von Dark Agouti auf Lewis Ratten durchgeführt. Es erfolgte eine immunsuppressive Therapie mit Tacrolimus in unterschiedlicher Dosierung (0, 1, 3, 5 mg/kg KG). Zu definierten Zeitpunkten wurden Blutproben (-1, 0, 3, 5, 7, 14, 45 Tage) sowie Organproben (7, 14, 45) entnommen. CD3, Perforin, α-1,2-Mannosidase, TOAG-1 und B-Zell- IgG-Spiegel wurden mittels RT-PCR, LBP durch ELISA und die Alloantikörper mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die H&E; gefärbten Schnitte der Organproben wurde nach einem Scoring-System histologisch in vier Abstoßungsgrade (keine Rejektion, akut, schwer chronisch, moderat chronisch) eingeteilt. Mittel- (D3) und hochdosierte (D5) Tiere zeigten eine signifikant verlängerte Überlebenszeit im Vergleich zu unbehandelten (D0) und niedrigdosierten (D1) Tieren. In Organproben der D0- und D1-Gruppe war bereits nach 7 Tagen eine schwere akute zelluläre Abstoßung zu sehen. Nach 45 Tagen zeigte sich zudem ein deutlich schwerer chronischer Zellschaden in Organproben von D3-behandelten Tieren als bei D5-behandelten (moderat chronische Abstoßung) Ratten. Die Genexpression von CD3, Perforin, B-Zell-IgG sowie der Plasma-LBP-Spiegel zeigten einen signifikanten Anstieg im Rahmen einer ablaufenden akuten oder chronischen Abstoßungsreaktion. Es konnte jedoch keine relevante Korrelation zwischen dem Plasma-Spiegel im frühen Stadium nach DDTx und dem histologischen Bild einer später ablaufenden Rejektion beschrieben werden. Im Gegensatz dazu konnte für Alpha-1,2-Mannosidase und TOAG-1 in allen transplantierten Gruppen eine frühzeitige Reduktion der Genexpression sowie für die Alloantikörper eine zeitnahe Elevation des Spiegels detektiert werden. Da sich bei TOAG-1 bereits an Tag 5 ein signifikant geringerer Spiegel in der D3-Gruppe als in der D5-Gruppe und bei den Alloantikörpern an Tag 7 ein signifikant höherer Spiegel in der D3 als in der D5-Gruppe zeigte, erscheint besonders bei diesen beiden Markern ein deutliches Potential zur frühzeitigen Vorhersage einer moderaten oder schweren chronischen Rejektion zu liegen.

Nowadays the only causal therapy of short bowel syndrome or functional intestinal failure is an intestinal transplantation (ITx). Despite intensive efforts there is still a lack of early noninvasive rejection markers. In this context, we investigated the diagnostic potential of seven markers (CD3, perforin, TOAG-1, α-1,2-mannosidase, LBP, B-Cell-IgG and alloantibodies), isolated from peripheral blood leucocytes as well as from organ samples. Therefore an orthotopic ITx from Dark Agouti into Lewis rats was performed. Tacrolimus in different dosages (0, 1, 3, 5 mg/kg) served as immunosuppressive therapy. Blood samples were collected at different time points after ITx (day -1, 0, 3, 5, 7, 14, 45). Grafts were recovered after 7, 14, and 45 days. CD3, perforin, α-1,2-mannosidase, TOAG-1, and B-cell-IgG gene expression were evaluated by real-time RT-PCR, LBP by ELISA, and alloantibodies by flow cytometry. H&E; dyed sections of the organ samples were divided into four grades of rejection (no rejection, acute, severe chronic, moderate chronic) based on a newly developed scoring system. Medium (D3) and high (D5) dose treated recipients revealed a significantly prolonged graft survival in contrast to untreated (D0) and low dose treated animals. The latter showed signs of severe acute rejection as early as day 7 post-transplantation. 45 days after ITx, severe chronic structural changes had developed in medium dose animals whereas animals of the D5 treated group showed just signs of a moderate chronic rejection. Gene expression of CD3, perforin, and B-Cell-IgG, as well as plasma LBP level revealed a significant increase during an ongoing acute or chronic rejection. However, there was no relevant correlation between plasma levels early after ITx and histological changes described during chronic rejection. In contrast α-1,2-mannosidase and TOAG-1 gene expression were decreased in all groups shortly after ITx. Accordingly, an early increase of peripheral alloantibody levels could have been detected. Since we observed a significantly lower TOAG-1 gene level on the 5th postoperative day as well as significantly higher alloantibody levels in D3 than in D5 treated recipients at day 7, especially these two markers promise to have a diagnostic potential concerning an early prediction of a moderate or severe chronic rejection.