Die Regulation der EGF-Rezeptor-Liganden Amphiregulin und Betacellulin in Kolonkarzinomzellen durch DNA-Methylierung

Abstract

Kolorektale Karzinome zählen zu den häufigsten malignen Erkrankungen des Menschen. Ihre Entstehung ist das Ergebnis einer Reihe molekularer Veränderungen, die in ihrer Summe zu unkontrolliertem Zellwachstum und unkontrollierter Zellvermehrung führen. Diese Veränderungen sind sowohl genetischer als auch epigenetischer Natur und werden von den Zellen an ihre Tochterzellen weitergegeben. Ein wichtiges Signalnetzwerk, das in kolorektalen Karzinomen häufig von Veränderungen betroffen ist, besteht aus der Ras-Raf- MEK-ERK-Signalkaskade, dem ihr vorgeschalteten Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und dessen Liganden. Störungen in diesem komplexen Netzwerk tragen maßgeblich zur Entstehung und zum Fortschreiten einer Vielzahl von Tumoren bei. Bei der Behandlung kolorektaler Karzinome rücken zunehmend Therapeutika in den Vordergrund, die gezielt an molekularen Besonderheiten des jeweiligen Tumors angreifen. Dazu zählen der Tyrosinkinase- Inhibitor Gefitinib und EGFR-Antikörper wie Cetuximab. Für die Entwicklung solcher gezielten onkologischen Therapiestrategien ist das detaillierte Verständnis der molekularen Grundlagen der Tumorenstehung unabdingbar. In der klinischen Praxis bedarf es zudem zuverlässiger prognostischer Marker, die einen gezielten und individualisierten Einsatz dieser Medikamente erlauben. Zusätzlich zu bereits etablierten Markern wie dem Mutationsstatus des K-Ras- Gens erlangen hier zunehmend auch Liganden des Epidermalen Wachstumsfaktors an Bedeutung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in kolorektalen Karzinomzellenzellen die Regulationsmechanismen der EGFR-Liganden Amphiregulin und Betacellulin zu untersuchen. Weiterhin sollte der Einfluß von Amphiregulin auf das Zellwachstum und auf das Ansprechen der Zelle auf in der Klinik gebräuchliche gezielte molekulare Therapien beleuchtet werden. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe war aufgefallen, daß die mRNA-Expression bestimmter EGF- Rezeptorliganden in kolorektalen Karzinomzellen abhängig vom DNA Methylierungsstatus der Zelle differentiell reguliert ist. Im Widerspruch zu den meisten in der Literatur beschriebenen Fällen korrelierte dabei ein hoher DNMT-Status mit einer vermehrten Expression der Liganden-mRNA. In der hier vorliegenden Arbeit konnte diese Beobachtung für die Liganden Amphiregulin und Betacellulin auf Proteinebene bestätigt werden. Ferner konnte durch direkte Inhibierung der DNA-Methyltransferasen und anschließende Bestimmung der Ligandenmenge gezeigt werden, daß zwischen dem Methylierungsstatus der Zelle und der Menge an gebildeten Liganden ein kausaler Zusammenhang besteht. In Folgearbeiten der Arbeitsgruppe wurde inzwischen für den Liganden Amphiregulin bestätigt, daß es sich bei dem hier gezeigten Phänomen um eine direkte Abhängigkeit infolge von Promotormethylierung handelt. DNA-Methylierung bewirkt eine potentiell reversible Veränderung des Expressionsverhaltens der Zelle und stellt somit einen möglichen Angriffspunkt für die Behandlung maligner Erkrankungen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluß von Amphiregulin auf das Zellwachstum und auf die Sensitivität gegenüber Gefitinib untersucht. Hier zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an gebildetem Amphiregulin und dem Proliferationsverhalten der Zelle. Außerdem ging ein höherer Amphiregulinspiegel mit einer höheren Sensitivität auf Gefitinib einher. Um zu untersuchen, ob die Amphiregulinmenge ursächlich für die erhöhte Sensitivität verantwortlich ist, wurde die Amphiregulin-Expression mithilfe spezifischer siRNAs unterdrückt. Allerdings gelang keine Hemmung, die über die gesamte für einen Wachstumsassay erforderliche Dauer anhielt, so daß die Frage nach dem Einfluß von Amphiregulin auf die Gefitinibsensitivität im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden konnte. Weiterhin wurden einzelne Zellinien auf ihre Sensitivität gegenüber Cetuximab untersucht. Cetuximab ist in Deutschland für die Behandlung von kolorektalen Karzinomen zugelassen, deren K-Ras-Gen in unmutierter Form vorliegt. In der jüngeren Literatur finden sich aber Hinweise, nach denen K-Ras-mutierte Tumore nur dann resistent gegenüber Cetuximab sind, wenn die Mutation Codon 12 des K -Ras-Gens betrifft. Liegt die Mutation im Bereich von Codon 13, ist das Therapieansprechen mit dem der unmutierten K-Ras-Variante vergleichbar. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse untermauern diese These, sollten aber in Zellinien verifiziert werden, die keine weiteren den Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweg betreffenden Mutationen aufweisen. Sollten sich diese Hinweise bestätigen und auf weitere Tumorsysteme ausweiten lassen, könnte die Bestimmung von Amphiregulin im Patientenserum einen zusätzlichen prädiktiven Faktor bezüglich des Therapieansprechens darstellen.

Introduction: Colorectal carcinoma is one of the most common malignant diseases to affect humans. It develops as the result of a series of molecular alterations, the sum of which leads to uncontrolled cell growth and reproduction. These alterations are both genetic and epigenetic in nature and are passed along from one generation of cells to the next. An important signaling pathway which is frequently subject to alterations in colorectal carcinoma consists of the Ras-Raf-MEK-ERK-signaling cascade in interaction with the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its ligands. Dysfunctioning of this network majorly contributes to the formation and progression of a significant number of tumor entities. For the development of targeted anti-oncological agents, a profound understanding of the molecular mechanisms underlying tumor development is paramount. In recent years different therapeutic agents have been developed that are capable of specifically targeting molecular characteristics of the respective tumor. Among these are Gefitinib, an inhibitor of the EGFR-tyrosine-kinase, and antibodies against the EGF-receptor such as Cetuximab. To allow targeted and individualized use of these agents, reliable prognostic markers of therapeutic response are crucial. Adding to already established ones like the K-Ras mutation status, new markers like the EGFR ligands are increasingly gaining importance. In this thesis, the regulatory mechanisms of the EGFR-ligands Amphiregulin and Betacellulin where examined and the influence of Amphiregulin on cell growth and on responsiveness towards customary targeted molecular therapies was assessed. Methods and results: Preliminary studies had shown a differentially regulated mRNA expression rate for a set of EGFR ligands. Surprisingly, gene expression appeared to be upregulated upon methylation. Using enzyme immuno assays, this observation was successfully verified for Amphiregulin and Betacellulin on protein level. By pharmacologically inhibiting DNA methyltransferases and subsequently quantifying the amount of ligand protein, this connection was shown to be causally determined. Follow-up studies of the group have confirmed the regulation to be directly dependent on promoter methylation. It was further shown that Amphiregulin levels correlated positively with cell proliferation rates. By conducting growth assays and specifically suppressing Amphiregulin expression via siRNAs, indications where obtained according to which high Amphiregulin levels correlate with a high sensitivity towards Gefitinib. Additionally, various cell lines were examined as to their sensitivity towards the EGFR antibody Cetuximab. Cetuximab is approved for the treatment of colorectal cancer harboring wild-type K-Ras. However, there is mounting evidence that only those K-Ras-mutated tumors appear to be resistant to Cetuximab whose mutation affects Codon 12. Codon 13 mutations, on the contrary, lead to a therapy response comparable to that of unmutated K-Ras. The results obtained in this thesis support this hypothesis. However, it is necessary that they be verified in cell lines showing no further mutations affecting the Ras-Raf-MEK-ERK signaling pathway. Conclusion: The regulation of the EGFR ligands Amphiregulin and Betacellulin was shown to be dependent on DNA-methylation. Inducing a potentially reversible change in a cell’s expression behaviour, DNA methylation constitutes a possible target for oncological therapies. Secondly, a correlation between Amphiregulin levels and cell proliferation rates as well as cells’ responsiveness towards Gefitinib was observed. Should these indications be confirmed and proved to be applicable to other tumor systems, measuring Amphiregulin levels in patient serum could become an additional valuable tool for accurately predicting patients’ responses towards targeted therapies.