RNA-Editing in Pflanzen führt zur Veränderung von Cytidinen zu Uridinen (C zu U) in mitochondrialen und plastidären Transkripten. Um dieses Phänomen besser verstehen und die an dieser Modifikationsreaktion beteiligten Faktoren identifizieren zu können, wurden bereits in vivo-, sowie in organello- und in vitro-Systeme entwickelt, die jedoch sehr zeitaufwendig sind oder nur geringe Editingaktivität zeigen. Von zentraler Bedeutung bei der Untersuchung des RNA- Editings in vitro ist daher die Sensitivität des Nachweissystems. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Detektionsmethode, die Primer-Ligation, mit der ein C zu U-Umsatz von deutlich unter 1 % nachgewiesen werden konnte, beruht auf einer Ligationsreaktion, die zwei mit dem Editingsubstrat gepaarte Oligonucleotide bei vollständiger Komplementarität an der Editingstelle spezifisch miteinander verknüpft. Mit dieser neuen Methode gelang es, zuverlässige mitochondriale und plastidäre in vitro-RNA-Editingsysteme zu etablieren, die sogar bis zu 5 % RNA-Editingaktivität aufwiesen. Dabei zeigte das mitochondriale Erbsensystem ebenso heterologes RNA-Editing wie Kartoffelmitochondrien in einem zusätzlich etablierten in organello-System an den zwischen der Erbse und der Kartoffel konservierten Editingstellen der atp9-RNA. Für diese mitochondriale RNA konnte darüberhinaus in einem plastidären Erbsen-in vitro-System organellenheterologes Editing nachgewiesen werden, sodaß nicht nur Mitochondrien, sondern offensichtlich auch Chloroplasten über die essentiellen Komponenten des atp9-RNA-Editings verfügen. Zur Analyse der genauen Sequenzanforderungen an das Editingsubstrat wurde in der vorliegenden Arbeit eine Kompetitionsanalyse entwickelt, die Desoxyoligonucleotid-Kompetitoren zur Hybridisierung an die RNA nutzt, um die Interaktion mit potentiellen Editingfaktoren zu verhindern. Mit Hilfe dieser neuen Methode ist es erstmalig gelungen, für das atp9-RNA-Editing ein essentielles cis-Element im nahen Upstreambereich der Editingstelle 1 zu identifizieren. Für das 10 Nucleotide umfassende Element konnte über "Linker Scanning"-Mutagenese nicht nur die Lage bestätigt, sondern darüberhinaus im in vitro- sowie im in organello-System erstmalig direkt gezeigt werden, daß der Abstand zur Editingstelle ("Spacing") selbst von zentraler Bedeutung für die Editingreaktion ist. Gleichzeitig zeigte die Analyse der atp9-Insertionsmutanten, daß die C zu U-Umwandlung der Editingstelle 2 unabhängig von der Editingstelle 1 determiniert wird. Durch die vorliegende Arbeit ist nun die Grundlage geschaffen, die Regulation des RNA-Editings über die Identifzierung von cis-Elementen und potentieller trans-Faktoren aufklären und die Entstehung dieses enigmatischen Prozesses besser verstehen zu können.
RNA editing in mitochondrial and plastidic transcripts of plants results in the modification of cytidines to uridines (C to U). In vivo, in organello and in vitro systems have been already established to better understand this phenomenon and to identify factors involved in this modification reaction. Nevertheless, they are either time consuming or show only low editing activity so that it is very important to have a very sensitive detection system for investigating RNA editing in vitro. The here developed assay, the primer ligation, can detect less than 1 % C to U editing. It is based on the annealing of two oligonucleotides to the editing substrate and a following ligation if perfectly matched at the editing site. Via this method reliable mitochondrial and plastidic in vitro RNA editing systems could be established with editing activities of up to 5 %. The mitochondrial pea system showed heterologous RNA editing at the conserved sites of the atp9 RNA, as did the mitochondria from potato in an additionally established in organello system. Furthermore, for this mitochondrial RNA organell-heterologous editing also could be shown in a pea plastidic in vitro system suggesting that not only mitochondria but also chloroplasts contain all essential factors for the atp9 RNA editing. To exactly determine the sequence requirements in the editing substrate a competition analysis was developed which uses the hybridization of deoxynucleotide competitors to the RNA to inhibit the interaction with possible editing factors. With the help of this method an essential cis- element for atp9 RNA editing was identified for the first time in the upstream region of the editing site 1. Via linker scanning mutagenesis the position of this 10 nucleotide spanning element could be confirmed. Furthermore, the analysis of the insertion mutants showed in in vitro as well as in in organello systems that the distance (spacing) of the element to the editing site 1 is essential whereas the C to U conversion at the editing site 2 is performed independently. In this work the foundation has been laid for elucidating the regulation of RNA editing by identifying cis-elements and possible trans-factors and to better understand the origin of this still enigmatic process.