Identification and functional characterization of a de novo point mutation identified in a patient with non-syndromal microcephaly and intellectual disability

Abstract

Higher eukaryotes take advantage of alternative splicing to gain and expand the transcriptome complexity and proteome diversity without increasing the number of genes. In comparison to other organisms, the humans utilize the most complex alternative splicing events. With the increase of complexity along the evolution, the susceptibility of splicing to mis-regulation also increases. Although lots of mutations within splicing factors have been found to associate with various human diseases so far, only very few have been identified in the basal components of spliceosome as causing factors of human diseases. Consequently, it leads to a severe shortage of established human disease models to investigate the functions of these basal components. This thesis aims to identify and functionally characterize a key de novo mutation in a basal component of spliceosome putatively associated with a human disease. In this study, a missense heterozygous mutation in the gene snrpE was identified by the whole exome sequencing from a family with a child suffering from non-syndromal microcephaly and intellectual disability. The snrpE gene encodes the SmE protein, an indispensible spliceosomal component. The gene as well, the mutated site is deeply conserved in different species. The available 3D structure data indicates that the point mutation might affect the assembly of snRNPs, which could be supported by our biochemical and immunofluorecent results showing the decreased integration capacity and aberrant cytoplasmic enrichment of the mutant protein. To further investigate the functional relevance of the identified mutation on splicing pattern at the whole transcriptome level, the RNA-seq was applied and the results showed that the mRNA splicing is abnormal in the patient derived fibroblasts and increased intron retention is the major defect. Similar effect on mRNA splicing can be recapitulated in SmE deficient HEK293 cells induced by siRNA knock down approach, indicating the pivotal role of this mutation in the splicing function of SmE. To clearly pinpoint the function of this mutation, we combined the recently developed CRISPR/Cas9 and piggyBac transposon system to introduce the mutation into the genomic loci in HEK293 cells. The RNA-seq data showed again that the mutation can induce a similar splicing defect as observed in the patient derived fibroblasts. Taken together, our results showed that the de novo missense mutation we identified affects the functional amount of snRNPs by interfering the early assembly phase, leading to the transcriptome-wide mRNA aberrant splicing.

Nahezu alle protein-codierenden Gene höherer Eukaryonten enthalten nicht- codierende Sequenzabschnitte (Introns), welche die codierenden Abschnitte (Exons) unterbrechen. Für die Ausbildung des offenen Leserahmens werden die Introns durch einen komplexen Prozessierungsschritt, dem sog. Spleißen, entfernt und die Introns präzise zur reifen mRNA vereinigt. Dieser Prozess wird durch das Spleißosom katalysiert, einer makromolekularen Maschine bestehend aus kleinen RNA-Proteinkomplexen (snRNPs) und einer großen Anzahl von Proteinfaktoren. Speziell bei höheren Eukaryonten findet man neben dem kanonischen Spleißen auch das sog. alternative Spleißen, d.h. die wahlweise Inklusion bzw. Exclusion von Exons in einem Transkript. Dieser Prozess ist hoch-reguliert und erlaubt die massive Ausweitung der Transkriptom- bzw. Proteom diversität, ohne dabei die Anzahl ihrer Gene zu erhöhen. Genetische Krankheiten des Menschen werden häufig durch Mutationen in den Spleißsignalen auf der mRNA oder in Spleißfaktoren gefunden. Jedoch sind bislang nur sehr wenige Fälle bekannt, bei denen Mutationen in den Hauptbestandteilen der Spleißmaschinerie menschliche Krankheiten hervorrufen. Dies führt zu einem Engpass an etablierten Modellkrankheiten, die zur Erforschung grundlegender Faktoren und deren Funktionen dienen könnten. Ziel der Dissertation war die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einer de novo Mutation in einem konstitutiven Bestandteil des Spleißosoms, welche vermeintlich in Verbindung zu einer menschlichen Erkrankung steht. Hierbei handelt es sich um eine Missense-Mutation im snrpE Gen. Diese wurde mittels Exomsequenzierung in einer Familie identifiziert, deren Nachkommen Mirkozephalie und geistige Retardation aufweist. Das snrpE Gen codiert für das evolutionär hoch- konservierte SmE Protein, einem essentiellen Grundbaustein des Spleißosoms. Kristallstrukturen des Proteins weisen darauf hin, dass die Punktmutation die Inkorporation des Proteins in das Spleißosom beeinflussen könnte. Diese Vermutung wurde durch biochemische und Zellbiologische Untersuchungen in dieser Arbeit bestätigt. Zum einen zeigen Immunofluoreszenz Untersuchungen die verminderte Integrationsfähigkeiten und anomale zytoplasmatische Anreicherung des Mutierten SmE Proteins. Zum anderen zeigen biochemische Untersuchungen, dass die Zusammenlagerung der snRNPs gestört ist. Da das SmE Protein ein Grundbaustein des Spleißosoms ist, lag die Annahme nahe, dass die mRNA Prozessierung ebenfalls betroffen ist. Um dies zu Untersuchen, wurden Fibroblasten des Patienten hergenommen um deren RNA zu Sequenzieren. Hierbei wurde deutlich, dass einbehaltende Introns den Haupteffekt darstellen und somit das Spleißen gestört ist. Um die Effekte der Mutation Patientenunabhängig betrachten zu können, wurden zusätzliche Experimente in der Zellkultur an HEK293 Zellen durchgeführt. Hierfür wurden zum einen mittels siRNA die Menge an SmE vermindert und zum anderen mit Hilfe der kürzlich entwickelten CRISPR/Cas9 und piggyBAC Transposon Systeme die Mutation des Proteins künstlich in die Zellen eingebracht. Sowohl die Verminderung von SmE als auch die künstliche Mutation zeigten die gleichen Auffälligkeiten wie die Spleißanomalien des Patienten. Zusammenfassend zeigten unsere Experimente, dass die von uns identifizierte de novo Missense-Mutation, die Funktionalität des Spleißosoms erheblich einschränkt. Ausgelöst wird dies durch ein eingeschränktes Zusammenlagern der kleineren snRNP Proteinkomplexe. Diese Einschränkung führt zu transkriptomweiten abnormen Spleißen.