LPA signalling during axon growth: Rule for PRG-1/ RAS GRF-2 interaction

Abstract

Plasticity Related Gene-1 (PRG-1) is a brain-specific membrane protein and the first identified member of the Plasticity Related Gene family (PRG-1-5). PRGs belong to the Lipid Phosphate Phosphatase (LPP) superfamily whose members have an extracellular ectoenzymatic activity known to dephosphorylate Lysophosphatidic Acid (LPA) into its inactive monomers (Monoacylglycerol (MAG) and phosphate). PRG-1 is also known to act specifically at the excitatory synapse on hippocampal neurons and has been recently proposed as an important player in the modulatory control of hippocampal excitability by means of non- enzymatic control of extracellular LPA concentration. The non-enzymatic control occurs at the synaptic level but its exact process is not clarified yet. The interaction between PRG-1 and the Ras-specific exchange factor: Ras Guanosine Release Factor-2 (Ras GRF-2) has been identified. PRG-1/Ras GRF-2 interaction takes place not only after overexpression of both proteins in mammalian cells, but also in cortical primary neuronal cultures when analysing endogenous PRG-1/Ras GRF-2 interaction. Furthermore, the endogenous PRG- 1/Ras GRF-2 interaction is disrupted after extracellular LPA application and not after the application of the Thrombin activator: Thrombin Receptors Peptide (TRP) known to have a similar effect on cell fate but through distinct receptors. It has also been found that PRG-1 protein-protein interaction controls the intracellular levels of the active protooncogene N-Ras and indeed the N-Ras activation is regulated depending on the extracellular concentration of LPA. To assess the intracellular signalling cascade, phosphorylation of Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) has been analysed; enhanced MEK/ERK activation but no p38 phosphorylation could be detected in cell culture after LPA application. And finally, significant axon elongation could be demonstrated after increasing the protein level of active N-Ras in primary neurons. Presented results will conclude showing PRG-1 as a Ras-cascade controller, during brain development mainly through Ras GRF-2 and depending on extracellular LPA presence. In the final schematic representation will be showed how extracellular LPA controls, in turn, Ras GRF-2 resulting in a decreased amount of active N-Ras protein known to induce axon growth during neuronal differentiation as well as to be deregulated in tumors. Newly presented data are the first results on PRG-1 function after its discovery on 2003 and the obtention of the PRG-1-/- animals on 2009. They represent a significant step further towards the understanding of the protein, its function during embryonal brain development but also its role in pathologies such as brain injury or cancer.

Plasticity Related Gene-1 weist eine weitgehend gehirnspezifische Expression auf. Das PRG-1 Protein wurde als erstes Mitglied der Plasticity Related Genes Familie (PRG-1-5) identifiziert. Die PRG-Familie gehört zu den Lipid Phosphatase/Phosphotransferasen (LPP), die an der Regulation des LPA-Spiegels beteiligt sind. LPP Familienmitglieder haben eine ektoenzymatische Aktivität, die LPA zu zwei inaktiven Monomere, Monoacylglicerol (MAG) und Phosphat (P), degradiert. PRG-1 ist ein Protein, das die hippocampale Erregbarkeit über die Regulation des LPA-Spiegels moduliert. Es wird vermutet, dass PRG-1 einen nicht-enzymatischen Einfluss auf Synapsen hat, welcher abhängig von der extrazellulären LPA-Konzentration ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen PRG-1 und Ras-specific Exchange Factor: Ras Guanosine Release Factor-2 (Ras GRF-2) untersucht. DieseWechselbeziehung wurde sowohl mittels Überexpression beider Proteine in Säugerzellen, als auch durch eine endogene Expression in kortikalen Neuronen analysiert. Darüber hinaus konnte hierbei LPA als spezifischer extrinsischer Faktor, der die Interaktion unterbricht, nachgewiesen werden. Anders als Thrombin, welches einen vergleichbaren Effekt auf Zellen hat wie LPA, jedoch nur LPA die Interaktion unterbindet und Thrombin keinen Einfluss auf diese Interaktion nimmt. Des Weiteren wurde bewiesen, dass PRG-1 Protein-Protein Interaktionen durch extrazellulläres LPA reguliert werden und gleichzeitig die Expression des intrazellulär onkogen aktiven N-Ras beeinflussen. Um zu kontrollieren ob PRG-1 als Membranprotein auf extrinsische Faktoren, wie zum Beispiel LPA, reagiert und somit eine intrazelluläre Signalkaskade auslöst, wurde die Phosphorylierung der Mitogen Aktivated Protein Kinase (MAPK) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine MEK/ERK Aktivierung, in Gegenzätz zur p38 Phosphorylierung, nach LPA Behandlung vorhanden ist. Detaillierte morphologische Analysen an N-Ras überexprimierenden primären Neuronen zeigten eine Verlängerung der Axone. Die im Verlauf dieser Arbeit generierten Daten zeigen PRG-1 als Regulator der Ras-Kaskade in Abhängigkeit von extrazellulärem LPA und Ras GRF-2. Aufgrund der Zusammenfassung ergibt sich die Hypothese, dass extrazelluläres LPA indirekt Ras GRF-2 beeinflusst. Dieses führt zu einer Abnahme von aktivem N-Ras, welches das Auswachsen der Axone während der neuronalen Differenzierung begünstigt und die Entwicklung von Tumoren negativ beeinflussen kann. Diese zum ersten Mal präsentierten Daten sind die ersten Resultate zur Funktion von PRG- 1 seit seiner Entdeckung im Jahre 2003 und der Herstellung von PRG-1-/- im Jahre 2009. Die Daten liefern einen Fortschritt im Verständnis der Funktion von PRG-1 während der embryonalen Gehirnentwicklung und dessen Rolle bei pathologischen Veränderungen, wie zum Beispel Gehirnverletzungen oder Krebs.