Biodiversität boviner Treponemen

Abstract

Die Dermatitis digitalis (DD) des Rindes ist eine wirtschaftlich bedeutende chronische Klauenerkrankung. Neben den bei dieser Mischinfektion typischerweise vorkommenden anaeroben Keimen wie Porphyromonas spp. oder Prevotella spp. sind ebenfalls verschiedene Treponema spp. in großer Anzahl in erkrankten Klauenbereichen vorhanden, so dass diesen Keimen ebenfalls eine Mitbeteiligung in der Pathogenese der DD zugesprochen wird. Gegenstand dieser Arbeit war es daher, einerseits die Diversität und mögliche Mitbeteiligung von Treponema spp. bei der Dermatitis digitalis des Rindes zu validieren. Weiterhin sollte ein möglicher Infektionsweg beteiligter Treponema spp. über den Gastrointestinaltrakt des Rindes aufgezeigt werden, da dieser immer noch ungeklärt ist. Untersucht wurden hierzu 58 Bioptate aus erkrankten Klauen sowie Kot- und Pansensaftproben. Neben der konventionellen Anzucht kamen insbesondere die molekularen kulturunabhängigen Nachweisverfahren DNA-DNA Dot blot-Hybridisierung sowie die Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) zur Anwendung. In Rahmen der konventionellen Anzucht konnten charakteristischerweise Porphyromonas levii in 80%, Prevotella spp. in 72%, weitere Porphyromonas spp. in 52% sowie Bacteroidaceae spp. in 28%, der Bioptatproben neben anderen Anaerobiern am häufigsten nachgewiesen werden. Auch konnten 7 identische Treponema-Isolate angezüchtet werden, die nach Genotypisierung basierend auf der 16S rDNA-Analyse die größte Übereinstimmung mit Treponema socranskii aufwiesen. Mittels der DNA-DNA Dot blot- Hybridisierung konnten die Treponema-Phylotypgruppe TRE I in 47, die Phylotypgruppe TRE II in 45, die Phylotypgruppe TRE IV in 45 sowie der Phylotyp DDKL-4 in 53 und DDKL-12 ebenfalls in 53 der Bioptatproben nachgewiesen werden. Nicht nur der Umstand, dass die Phylotypgruppen TRE I, II, IV sowie die Phylotypen DDKL-4 und DDKL-12 detektiert werden, sondern auch das gleichzeitige Vorkommen von bis zu 5 der genannten Treponema-Gruppen in derselben Probe belegt den hohen Grad der Diversität von Treponemen im Rahmen der DD. Die Ergebnisse der FISH untermauern die mögliche pathogenetische Bedeutung von Treponemen, denn die Phylotypgruppen TRE I, II, und IV und der Phylotyp DDKL-4 konnten innerhalb der Epidermis nachgewiesen werden. Zudem stellten Treponemen einen Grossteil der insgesamt im Gewebe vorkommenden Bakterienpopulation dar.

Ein Nachweis der in den Bioptaten vorkommenden Treponemen in Kot- und Pansensaft gelang hingegen nicht. Allerdings könnte dies durch die geringe Nachweisempfindlichkeit von mindestens 3x106 Keime/250 mg Faeces bedingt sein, so dass es weiter ungeklärt bleibt, ob der Gastrointestinaltrakt des Rindes das Habitat und somit Infektionsquelle der bei der DD mitbeteiligten Treponemen ist. Deshalb müssen weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Treponema-Infektionsquelle durchgeführt werden.

Dermatitis digitalis (DD) is an important disease of claws in cattle. It is a chronic infection mainly of the epidermis typically associated with several anaerobe bacteria like Porphyromonas spp. and Prevotella spp. Furthermore Treponema spp. can be detected in large numbers in affected samples so that they are assumed to play an important rule in the pathogenesis of DD.Therefore the aim of this study was to evaluate the high diversity and the influence of bacteria of this genus in causing DD on the one hand and to rule out one possible way of infection via the gastrointestinal tract on the other as the aetiology of this disease still remains unclear. Beside standard cultivation techniques, culture-independent detection methods were applied utilizing DNA- DNA dot blot hybridisation and fluorescence in situ hybridisation (FISH). 58 biopsies from affected cows were examined as well as samples of feces and rumen fluid in order to point out the gastrointestinal tract as a possible source of treponemal infection. By conventional cultivation most predominantly Porphyromonas levii could be detected in 80% of the biopsy samples, Prevotella spp. in 72%, Porphyromonas spp. in 52% as well as Bacteroidaceae spp. in 28% of the samples, bacteria that typically occur in DD. Furthermore seven identical Treponema isolates have been cultivated that are mostly related to Treponema socranskii based on 16S DNA analysis. By DNA-DNA dot blot hybridisation techniques several different Treponema phylotypes could be detected in those biopsies. Treponema phylotype group TRE I could be detected in 47 biopsies, phylotype group TRE II in 45 and phylotype group TRE IV in 45 of the samples whereas 53 of the biopsies were positive for the phylotypes DDKL-4 and DDKL-12. The fact, that phylotype groups TRE I, II, IV, phylotypes DDKL-4 and DDKL-12 were diagnosed, as well as the occurrence of up to five different Treponema phylotypes in identical biopsy sample clearly points out the high diversity of this genus associated with DD. FISH also gave positive results for TRE I, II, IV and DDKL-4, identifying these bacteria not only superficially but also in deeper tissue of the epidermis. In addition Treponema spp. represent a large portion of the total microbiota in DD affected lesions. These results indicate that Treponema spp. are most probably involved in causing and maintaining DD. Probably due to limited detection ranges of at least 3x106 cells/250 mg feces it was not possible to detect Treponema spp. in feces or rumen fluid samples. It therefore still remains unclear whether the gastrointestinal tract of cattle serves as a possible source of infection with Treponema spp. Further examinations have to be performed to unravel the exact aetiology of DD.