Vergleich der Genexpression auf Transkriptionsebene in der Lunge mittels Mikroarray-Technologie in einem Mausmodell des akuten und chronischen Asthma bronchiale

Abstract

Das allergen-induzierte Asthma bronchiale zählt in den Industrienationen zu den häufigsten chronischen Krankheiten bei Kindern und Jugendlichen. Ausgelöst durch multiple Triggerfaktoren liegt der Erkrankung das Zusammenspiel verschiedener prädisponierender Gene und inflammatorischer Pathomechanismen in der Lunge zugrunde. Im Tiermodell kann die akute allergische Reaktion mit Ig-E-vermittelter Mastzell-Degranulation, der Einwanderung von Entzündungszellen und der Ausbildung von Atemwegshyperreagibilität durch die spezifische Atemwegsprovokation von vorher sensibilisierten Tieren nachempfunden werden. Das Modell der Langzeit-Allergenprovokation führt analog zum Menschen zu zellulären und strukturellen Veränderungen, wie einer steigenden peribronchialen Kollagenablagerung, Fibroblastenhyperplasie und vermehrter Schleimproduktion. Um die zugrunde liegenden Mechanismen bei der Entstehung von Entzündung, Hyperreagibilität und strukturellen Veränderungen in der Lunge zu analysieren, wurden von uns zu verschiedenen Zeitpunkten der Allergenprovokation mRNA-Expressionsprofile aus Lungengewebe erstellt. Hierzu wurden Balb/C Mäuse zuerst intraperitoneal mit dem Modellallergen Ovalbumin (OVA) sensibilisiert und anschliessend unterschiedlich lange (akutes Modell: eine Woche; intermediäres Modell: sechs Wochen; chronisches Modell: zwölf Wochen) repetitiv mit OVA über die Atemwege provoziert. Die Analyse der immunologischen, histologischen und physiologischen Parameter ergab folgendes Bild: Die Gesamt-Ig-E Produktion erreichte nach sechs Wochen in den behandelten Tieren ein Maximum und blieb auf diesem hohen Niveau, wohingegen die Menge an OVA-spezifischem Ig-E im zwölfwöchigem Modell wieder abfiel. Die broncho-alveoläre Lavage der Lungen zeigte, dass die Gesamtzellzahl analog zur Provokationsdauer anstieg. Der eosinophile Granulozyt machte hierbei in der akuten Phase, sowie nach sechs Wochen den Großteil der Zellen aus und verringerte sich in der chronischen Phase dann deutlich. Auch die histologische Auswertung der peribronchialen Entzündung und der Becherzellhyperplasie ergab, dass die Entzündungsreaktion im chronischen Modell, im Gegensatz zum akuten und intermediären Zeitpunkt, deutlich zurückging. Als klinischer Parameter wurden Lungenfunktionsmessungen an den Mäusen durchgeführt. Es zeigte sich, dass im zeitlichen Verlauf der Provokation die Hyperreaktivität abnahm. Die mRNA-Expressionsanalysen der Lungen zu den oben beschriebenen Zeitpunkten erfolgte mittels Microarray (Affymetrix, Mouse Genome 430 2.0). Insgesamt wurden 1644 Gene gefunden, die jeweils mindestens zweifach gegenüber der Kontrollgruppe reguliert waren. Durch die Hauptkomponentenanalyse (PCA) ließen sich die einzelnen Zeitpunkte deutlich voneinander abgrenzen. Im Detail zeigten sich im akuten Modell 577 Gene (450up/127down), im sechswöchigen Modell 1176 Gene (730up/446down) und im chronischen Modell 583 Gene (433up/150down) mindestens zweifach reguliert. Zu allen drei Zeitpunkten waren insgesamt 263 Gene (247up/16down) reguliert. Mittels funktioneller Clusteranalysen wurden die einzelnen Zeitpunkte näher charakterisiert; hierbei ließen sich die regulierten Gene verschiedenen Pathways und funktionellen Gruppen zuordnen. Zu allen Zeitpunkten waren Gene aus der Gruppe „response to stimulus“, der Immunantwort und der extrazelluläre Matrix reguliert. Im akuten Modell fanden sich Teile des Toll-like-Rezeptor (z.B. TLR1) und Jak-Stat Rezeptor Pathways reguliert. Die Antikörper-Antigen- Komplexe der Complementkaskade zeigten eine Induktion vor allem in der intermediären Phase. Im akuten sowie im intermediären Modell fanden sich vor allem positiv regulierte Gene des Cytokin-Cytokinrezeptor-Pathway. Verschiedene Kettenanteile von Immunglobulinen waren im intermediären Modell mit am stärksten reguliert. Des Weiteren ließen sich Expressionsverläufe verschiedener, für die Pathogenese des allergischen Asthma bronchiale wichtiger Gene darstellen. Bei den klassischen TH2 Interleukinen wurde für IL-4 und IL-5 ein Maximum im intermediären Modell festgestellt. Interleukin-13 zeigte sich im Verlauf abfallend reguliert. Gene, die positiv auf die B-Zellentwicklung einwirken sowie deren Überleben verlängern – als Beispiel BLNK (b-cell linker) und BCL2A (B-cell leukemia/lymphoma 2a) – waren zu allen Zeitpunkten positiv reguliert. Auch Faktoren, die den durch die allergische Reaktion ausgelösten progredienten Umbau in der Lunge beeinflussen, fanden sich reguliert. So zeigte IL-6, dem eine wichtige Rolle in der Induktion des Remodelings zugesprochen wird, eine Hochregulation in der intermediären Phase. Analog zeigte sich Mmp12 (matrixmetallopeptidase 12) als pro-fibrotischer Faktor im zeitlichen Verlauf ansteigend und deren Gegenspieler Timp1 (tissue inhibitor of metalloendopeptidasen 1) vom akuten zu den chronischen Modellen abfallend reguliert. Analog zu der im Verlauf abnehmenden Inflammation fanden sich Gene, welche inhibitorisch auf an der asthmatischen Reaktion beteiligten Zellen wirken, in den chronischen Versuchen hochreguliert. Als Beispiel LILRB4 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4) mit einer hemmenden Wirkung auf Mastzellen und NKs. Die mittels Mikroarray gefundenen Regulationen einzelner Gene wurde via quantitativer PCR überprüft und konnten bestätigt werden. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit viele dem allergischen Asthma bronchiale bereits zugeordnete Gene bestätigt und zudem neue Gene aufzeigt werden. Aktuell wird deren funktionelle Rolle und möglicher therapeutischer und präventiver Nutzen weiter untersucht. Die Mikroarraytechnologie bietet somit eine valide Möglichkeit, das Verständnis der Pathogenese des Asthma bronchiale zu verbessern und neue Ansatzpunkte für die Intervention aufzuzeigen.

Asthma is one of the most common chronic diseases among children. Multiple trigger factors cause a persisting inflammation of the lung with following structural changes. These changes and the pathomechanism can be shown in a mouse model and new targets can be found via gene expression profiling with microarray technology. In our model we used the allergen ovalbumin, after intra-peritoneal sensitization following the challenge via nebulization repetitively twice a week for 1, 6 and 11 weeks. We were able to show immunological parameters of the asthmatic phenotype with elevated immunoglobulines, mucus hypersecretion, bronchial-infiltration and elevation of the main TH2 interleukins IL-4, IL-5 and IL-13. The airway hyper- responsiveness (AHR) decreased during chronification. The microarray gene expression profile showed 1644 genes with a regulation of at least 2 folds. 577 genes (450up/127down) in the acute model (1wk), 1176 genes (730up/446down) at 6 weeks and 583 genes (433up/150down) in the chronic model. The activated pathways are the Toll-like receptor pathway, cytokines and cytokine-receptors and the b-cell pathway. During the acute and intermediate phase the group response to stimulus and the group extra-cellular matrix (ECM) were up- regulated. Within the ECM group genes of the collagen homeostasis showed to be highly inducted. In our quantitative analysis an elevated level of collagen appeared only in the intermediate phase. Furthermore we were able to confirm multiple genes already associated with asthma. New potential targets were discovered while their definite function still needs to be explored. The regulation found via microarray analyses was confirmed through polymerase- chain-reaction (PCR). Concluding, microarray analysis is a powerful tool to show pathomechanism of complex diseases such as asthma and to reveal new potential targets for therapeutical and preventive intervention.