Prevalence and characterisation of adeno-associated virus (AAV): persistent infection in leukocytes of blood donors and immunosuppressed patients

Abstract

Adeno-associated virus (AAV) is ubiquitous but has not so far been associated with human disease. As a dependovirus, it has a biphasic AAV life cycle with latency phase and helper virus-induced productive replication phase. AAV in vivo persistence requires latency in specialized cell types to escape the host immune response until viral spread becomes possible. Reactivation from latency can be triggered by diverse stimuli including host immunosuppression. AAV has been thoroughly studied in vitro, but not in vivo. In view of the growing success of AAV-derived vectors in human gene therapy, it is becoming increasingly urgent to identify the in vivo target cells of wild-type AAV persistence to approach a better understanding of AAV in vivo biology. We developed a highly sensitive and specific AAV PCR assay for the full spectrum of known human AAV serotypes. Using AAV PCR assay, we screened genomic DNA samples from leukocytes of 243 healthy blood donors (BD) and 41 immunosuppressed patients (IS). We observed that AAV is highly prevalent in human leukocytes, perceived as a potential reservoir for AAV latency. AAV-DNA was detected in about 34% and 76% of healthy blood donors and immunosuppressed patients, respectively. Mixed AAV infections were observed in 11% and 45% of BD and IS, respectively. Serotypes detected were similar in both groups, predominantly AAV2, followed by AAV5. Other serotypes such as AAV1, 3, 6, 8 and 9 were less commonly isolated. The high prevalence and broad spectrum of human AAVs in leukocytes as detected by PCR closely follows AAV seroepidemiology. The higher AAV detection rate and mixed infection in immunosuppressed patients are highly statistically significant, suggesting a possible reactivation of latent AAV infection. Many recent studies correlated immunosuppression with an increased frequency of AAV capsid-specific T-cells, implying a potential role of immunosuppression in AAV reactivation. Some AAV- positive blood donors were repeatedly tested over a follow-up period of two years, and showed a repeated detection of the initial and/or additional AAV serotypes in many cases, suggesting persistent infection with fluctuating AAV viral load levels. Cloning of PCR products, where raw sequencing data showed superimposed peaks, confirmed our postulation of even an underestimated mixed infection using consensus primers and explaining the alternate detection of different AAV serotypes. It was then interesting to identify the target leukocyte subpopulation for AAV persistence. Leukocyte separation revealed that AAV2 resided exclusively in CD3+ T-lymphocytes, considered as the plausible in vivo reservoir of AAV persistence. AAV5 was detected once, notably in both CD3+ and CD3- fractions. Further experiments are required to further explore the leukocyte subpopulations for AAV persistence, as well as other human cells.

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist allgegenwärtig, ist aber bisher mit keiner menschlichen Erkrankung in Verbindung gebracht worden. Als Dependovirus hat es einen zweiphasigen AAV-Lebenszyklus mit einer Latenzphase und einer Helfervirus-induzierten produktiven Replikationsphase. Die AAV in vivo Persistenz erfordert Latenz in spezialisierten Zelltypen, damit der Kontakt mit dem Immunsystem vermieden wird, bis die virale Ausbreitung möglich wird. Die Reaktivierung aus der Latenz kann durch verschiedene Stimuli einschließlich Host-Immunsuppression ausgelöst werden. AAV wurde in vitro eingehend untersucht, aber nicht in vivo. Im Hinblick auf den wachsenden Erfolg von AAV-abgeleiteten Vektoren in der humanen Gentherapie wird es immer dringender, die in-vivo-Zielzellen für die -AAV-Wildtyp-Persistenz zu identifizieren und besseres Verständnis für die AAV in-vivo-Biologie zu gewinnen/erlangen. Wir entwickelten einen hochsensiblen und spezifischen AAV PCR-Assay, der eine Detektion des gesamten Spektrums der bekannten humanen AAV-Serotypen erlaubt. Mit diesem AAV PCR-Assay untersuchten wir 284 DNA- Proben aus Leukozyten, die von 243 gesunden Blutspendern und 41 immunsupprimierten Patienten stammten. Wir beobachteten eine deutliche Präsenz des AAVs in menschlichen Leukozyten, sodass sie möglicherweise als potentielles Reservoir für latente AAVs fungieren. Die AAV-DNA wurde in etwa 34% der gesunden Blutspender und 76% der immunsupprimierten Patienten detektiert. Zelluläre AAV-Infektionen mit mehreren AAV-Serotypen gleichzeitig wurden in 11% der Blutspender und 45% immunsupprimierten Patienten beobachtet. Überwiegend wurde das AAV-Serotyp 2 nachgewiesen, gefolgt von AAV5. All die anderen AAV-Serotypen wie AAV1, 3, 6, 8 und 9 kommen laut unserer Methode seltener vor. Die erhöhte Präsenz der AAV Einzel- und Mischinfektionen bei den immunsupprimierten Patienten ist im Vergleich zu Leukozyten der gesunden Blutspender statistisch hoch signifikant, was auf eine mögliche Reaktivierung der latenten AAV-Infektion hinweist. Laut neueren Studien korreliert die Immunsuppression mit einer erhöhten Frequenz von AAV-Kapsid-spezifischen Zellen, was auf eine mögliche Rolle der Immunsuppression in AAV Reaktivierung hindeutet. Die hohe Prävalenz bei der AAV-Präsenz und breites AAV Serotypen- Spektrum in menschlichen Leukozyten, die in dieser Arbeit durch den PCR-Assay nachgewiesen wurden, korreliert mit der beschriebenen AAV Seroepidemiologie. Einige der AAV-positiven Blutspender wurden über einen Beobachtungszeitraum von zwei Jahren wiederholt untersucht. Dabei konnte der detektierte AAV- Serotyp erneut und in vielen Fällen ein zusätzlicher AAV-Serotyp nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine persistierende AAV-Infektion hin, die allerdings einigen Schwankungen unterliegt. Des Weiteren wurden die klonierten PCR- Produkte auch unter Verwendung von Konsensus-Primern sequenziert, was unsere These von unterschätzten zellulären AAV-Mischinfektion bestätigt und eine Erklärung dafür gibt, warum in einigen Blutspendern verschiedene AAV-Serotypen zu unterschiedlichen Zeitpunkten detektiert wurden. Als Nächstes identifizierten wir die Subzellen der Leukozyten Population für die AAV Persistenz. Die MACS Methode ergab, dass AAV2 ausschließlich in CD3+ T-Lymphozyten residierte und lässt diese Subpopulation als in vivo Reservoir für das latente AAV2 vermuten. AAV5 wurde jedoch überraschend in beiden CD3+ und CD3- Fraktionen nachgewiesen. Die Frage nach der Subpopulation der Leukozyten so wie andere menschlichen Zellen für die AAV-Persistenz bedarf jedoch weitere Untersuchungen.