Entwicklung eines neuen Inflammationsmodells am Gehirn der neonatalen Ratte mittels Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (PMA)

Abstract

Perinatalen Infektionen des Frühgeborenen wird bei der Entwicklung eines frühkindlichen Hirnschadens eine sehr bedeutende Rolle zugeschrieben. Hierfür scheint eine Infektion des Kindes nicht notwendig, sondern denkbar ist, dass eine systemische inflammatorische Reaktion genügt, um eine Hirnschädigung herbeizuführen. Phorbol-12-Myristat-13-Azetat (PMA) ist als ein potenter Aktivator der Proteinkinase C bekannt und bewirkt in den Zellen des Monozyten- Makrophagen-Systems eine Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNFα, IL-1β und IL-6. Im Tiermodell ließen sich nach systemischer Injektion von PMA Entzündungsreaktionen in Form eines akuten Lungenödems und Zelltod nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher neonatalen Ratten PMA verabreicht um eine systemische Entzündungsreaktion zu imitieren mit dem Ziel ein Tiermodell zur Untersuchung der inflammatoinsgetriggerten Hirnschädigung zu entwickeln. Hierzu wurde 6 Tage alte Han Wistar Ratten PMA in verschiedenen Dosierungen (100, 200 oder 500 µg/kg Körpergewicht) intraperitoneal appliziert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere getötet und die Gehirne mittels DeOlmos Kupfersilber-, Fluoro-Jade-B-, TUNEL- und Caspase-3-Färbung histologisch untersucht, um degenerierte Zellen darzustellen. Ein anderer Teil der Tiere überlebte weitere 7 Tage beziehungsweise 14 Tage, so dass im Alter von 14 und 21 Tagen eine Kresylviolettfärbung zur Bestimmung der Gesamtdichte der Neurone durchgeführt werden konnte. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Dosis von 500 µg PMA/kg Körpergewicht zu einer signifikanten Neurodegeneration im Gehirn der 7 Tage alten Ratten führt, während bei Dosen von 100 und 200 µg/kg KG die Anzahl an untergegangenen Zellen sich im Bereich der Kontrolltiere bewegt. In Untersuchungen nach längerer Phase der PMA-Gabe konnte eine signifikant geringere Neuronendichte bei den Versuchstieren nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass inflammatorische Reaktionen eine direkte Wirkung auf das unreife Gehirn haben und nicht nur sekundär einen beispielsweise ischämisch verursachten Neuronenschaden verstärken. Bei vorangegangener inflammationsbedingter Neuronenschädigung ist daher eine Langzeitschädigung des unreifen Gehirns zu erwarten. Interessanterweise scheint jedoch gegenüber geringeren Inflammationsstimuli eine gewisse Toleranz des heranreifenden Gehirns zu bestehen. Das in dieser Arbeit etablierte, gut reproduzierbare Inflammationsmodell an der neonatalen Ratte bietet zukünftig die Möglichkeit, molekulare Mechanismen zu evaluieren mit dem Ziel neue Therapiestrategien gegen diese inflammationsbedingten Schäden des Frühgeborenen zu entwickeln.

Premature born infants often suffer from perinatal and postnatal infections. Using phorbol myrystyl acetat (PMA), an unspecific activator of protein kinase C (PKC), we investigated the effects of inflammatory reactions on the developing rodent brain. Six, 14 and 21 day-old Han Wistar rats were exposed to intraperitoneally (i.p.) injected PMA for 24 hours. Significantly increased neuronal cell death was assessed in the brain by Fluoro Jade B and silver staining. Using cresylviolett-staining we investigated long-time-effects of PMA-induced inflammation. Han Wistar rats received PMA i.p. one time at day six; their brains were assessed after seven respectively 14 days of survival. Results show a significant reduction of neuronal cell density in various brain regions. Neonatal infections might affect the neuronal development of the immature brain. IL-18 and PKC seem to be useful targets for anti-inflammatory therapeutic approaches to avoid neuronal loss in the immature brain.