5.1 Zusammenfassung FTY720 (Fingolimod) ist ein neuer Immunmodulator, dessen Zulassung zur Behandlung der schubförmig remittierenden multiplen Sklerose Ende 2009 beantragt wurde. Die Applikation von FTY720 führt zu einer Verkleinerung der Zahl der peripheren Lymphozyten. Grund hierfür ist allerdings keine gesteigerte Apoptose, sondern eine Umverteilung und Zurückhaltung der Lymphozyten in sekundäre Lymphorgane. FTY720 wird im Körper durch Sphingosinkinasen, hauptsächlich durch die SphK2, zu FTY720-Phosphat umgesetzt. Dieser Metabolit wirkt agonistisch an S1P1,3-5, führt aber ebenso zu einer Internalisierung des S1P1-Rezeptorsubtyps. Der dadurch entstehende Antagonismus ist entscheidend für die Wirkung auf die Lymphozyten. Neben der Umverteilung der Lymphozyten hat FTY720 einen Einfluss auf das Überleben von Zellen. In hohen Konzentrationen wirkt es stark apoptotisch in allen berichteten Zellarten. Dieser Effekt scheint unabhängig von einer Rezeptorbeteiligung zu sein. Liegt FTY720 als Phosphat und in niedrigen Konzentrationen vor, ist es in der Lage, Zellen vor dem Tod zu schützen. In der vorliegenden Arbeit konnte dieses kontroverse Verhalten bestätigt werden. Die Stimulation von humanen Fibroblasten und Keratinozyten mit FTY720 in einer Konzentration von 10 µM ließ die Zahl der apoptotischen Zellen auf über 80 % ansteigen. Der Einsatz von FTY720-P hingegen rief keine Apoptose hervor. Ganz im Gegenteil, die durch TNF-α / Actinomycin ausgelöste Apoptose konnte durch Vorstimulation mit FTY720-P in beiden Zellarten konzentrationsabhängig gesenkt werden. Die maximale Wirkung wurde bei einer Konzentration von 1 µM erreicht. Da FTY720 in vivo durch die SphK2 phosphoryliert wird, wurde diese Umwandlung auch in Fibroblasten untersucht. Es wurde eine Phosphorylierung gemessen, die allerdings nicht vollständig war. Das erklärt zwar einerseits den fehlenden apoptotischen Effekt von FTY720 bei 1 µM, aber andererseits nicht den ebenfalls fehlenden antiapoptotischen Effekt. Der Einsatz der SphK2-siRNA unterstreicht die Bedeutung der Phosphorylierung, denn nach Hemmung der Kinase war ein apoptotisches Verhalten von FTY720 schon bei 1 µM zu erkennen. Wird FTY720 also bis zu einer Konzentration von 1 µM eingesetzt, bildet sich ein Gemisch beider Substanzen, die sich in ihrer Wirkung auf die Apoptose aufheben. In höheren Konzentrationen überwiegt der zytotoxische Effekt des FTY720. Da FTY720-P seine Effekte über S1P-Rezeptoren vermittelt, wurde der beteiligte Subtyp näher charakterisiert. Die Versuche mit dem S1P1-spezifischen Agonisten SEW2871 und den Antagonisten VPC23019 und Suramin deuteten auf die Beteiligung des S1P3-Rezeptorsubtyps hin. Dies konnte durch die Verwendung von S1P3-Rezeptor-Knockout-Fibroblasten und -Keratinozyten bestätigt werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit sollte der Signalweg des antiapoptotischen Effektes von FTY720-P in Fibroblasten aufgeklärt werden. Im Fokus standen hier die dominanten Proteine PI3K / Akt, ERK1/2 und mTOR. Obwohl jeweils eine Phosphorylierung dieser Proteine in humanen Fibroblasten durch FTY720 und dessen Phosphat nachgewiesen wurde, konnten diese Signalproteine ausgeschlossen werden. Einerseits führte die Verwendung von Inhibitoren der Signalwege zu keiner Veränderung des antiapoptotischen Effektes von FTY720-P. Andererseits wurde eine Phosphorylierung ebenfalls in S1P3-Rezeptor-Knockout- Fibroblasten gemessen. Der Einsatz des Fluoreszenzfarbstoffes JC-1 offenbarte den ersten Unterschied zwischen FTY720-P und seiner Muttersubstanz. Das Phosphat war in der Lage, das mitochondrielle Membranpotential zu stabilisieren, während FTY720 dies nicht vermochte. Auch in Keratinozyten wurde die Beteiligung der Mitochondrien nachgewiesen. Darüber hinaus konnte der S1P3-Rezeptorsubtyp als essentiell bestätigt werden, da FTY720-P in Knockout-Fibroblasten keinen Effekt mehr aufwies. Als weiterer Faktor des intrinsischen Signalweges der Apoptose wurde das Protein Bcl-2 untersucht. FTY720-P führte zu einer deutlichen Phosphorylierung in humanen Fibroblasten. Interessanterweise war FTY720 dazu nicht in der Lage. Außerdem konnte in S1P3 -Knockout-Fibroblasten keine Phosphorylierung durch FTY720-P mehr ausgelöst werden. Die erhaltenen Ergebnisse stellen den zwiespältigen Charakter von FTY720 deutlich heraus. Da der apoptotische Effekt eher S1P-Rezeptor- unabhängig vermittelt wird, wäre eine genauere Untersuchung dieses Aspekts wünschenswert. Dasselbe gilt für eine weitere Aufschlüsselung des intrazellulären, antiapoptotischen Signalweges. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die genauere Untersuchung der Interaktion von S1P und Insulin hinsichtlich der Apoptose in Keratinozyten. Es war bereits bekannt, dass S1P die Insulin induzierte Proliferation von Keratinozyten hemmt. Dies wurde mit einer geringeren Akt-Phosphorylierung durch vorhergehende PKCδ-Aktivierung begründet. In der vorliegenden Arbeit konnte das ebenfalls schon berichtete antiapoptotische Potential von S1P in Keratinozyten bestätigt werden. Gleichzeitig verringerte es aber den durch Insulin ausgelösten antiapoptotischen Effekt. Die Beteiligung der PKCδ konnte in diesem Zusammenhang bewiesen werden. Zuerst imitierte der PKC-Aktivator TPA die S1P- Wirkungen in Bezug auf Insulin. Zusätzlich konnte durch Ausschalten der PKCδ mittels siRNA diese Isoform als essentiell identifiziert werden, da die Zahl der apoptotischen Zellen wieder sank. Der apoptotische Arm von S1P wurde so blockiert und es kam nur der zellschützende Arm zum Tragen. So wird deutlich, dass auch S1P unterschiedliche Effekte je nach Ausgangslage des Systems besitzt. Gerade dieser Fakt macht es so interessant und lässt einen positiven Einfluss auf hyperproliferative Hautkrankheiten vermuten. Dass TGF-β und Estradiol einen positiven Effekt auf die Migration von Brustkrebszellen auslösen und damit die Metastasierung fördern können, ist bereits länger bekannt. Die schon berichtete und hier bestätigte Hemmung der TGF-β induzierten Migration durch Vorinkubation mit Estradiol gibt allerdings neue Hinweise auf eine mögliche positive Beeinflussung des Tumorwachstums. Eine Hemmung der Smad-Phosphorylierung sowie eine Induktion der ERK1/2-Phosphorylierung durch E2 ist ebenfalls schon gezeigt worden. Dies konnte hier in MCF-7 Zellen bestätigt und darüber hinaus in gleichem Maße durch das nicht membrangängige E2-BSA ausgelöst werden. Dass die Aktivierung von ERK1/2 die Hemmung von Smad nach sich zieht, konnte hier einwandfrei durch den Einsatz des MAPK-Hemmstoffs U0126 demonstriert werden. Gleichzeitig wurde dadurch die Hemmung der Migration wieder aufgehoben. Einen gleichen Einfluss hatte die Verwendung von PTX. Auch hierbei wurden die Effekte von E2 blockiert. Die Verwendung von PTX sowie von E2-BSA bestätigt die Vermutung, dass die Wirkung von E2 in diesem Fall durch membranständige Rezeptoren vermittelt wird. Die Untersuchung zur Lokalisation des GPR30-Rezeptors ergab eine Kolokalisierung mit dem endoplasmatischen Retikulum. Die Bedeutung der Kolokalisierung sowie der Beteiligung membranständiger Rezeptoren an der Vermittlung der Effekte von E2 bleibt kontrovers und muss in Zukunft geklärt werden. Bei eindeutiger Beteiligung des GPR30-Rezeptors wäre eine Entwicklung spezifischer Arzneistoffe für die Behandlung des Brustkrebses von großer Bedeutung.
FTY720 (Fingolimod) is a novel immunomodulator which awaits approval for the treatment of patients with relapsing–remitting multiple sclerosis. Application of FTY720 leads to a decrease of peripheral lymphocytes. This effect is not due to increased apoptosis, but rather a sequestration in secondary lymphoid organs. FTY720 is phosphorylated in vivo mainly by SphK2. The metabolite FTY720-P acts agonistic on S1P1,3-5 but causes an internalization of the S1P1 receptor subtype. This creates a functional antagonism which is essential for the effect on lymphocytes. Besides the redistribution of lymphocytes, FTY720 has an impact on cell survival. High concentrations reveal strong apoptotic properties in every reported cell line. But this effect seems to be independent of receptors. Once FTY720 is phosphorylated and applied at low concentrations, it is able to protect cell from undergoing cell death. In the present study this controversial behaviour could be confirmed. Stimulation of human fibroblasts and keratinocytes with FTY720 at a concentration of 10 µM raised the number of apoptotic cells beyond 80 %. Instead, treatment with FTY720-P did not induce apoptosis. In fact, TNF-α / actinomycin induced apoptosis could be decreased by preincubation with FTY720-P in both cell types. The maximum effect was measured at a concentration of 1 µM. As FTY720 is phosphorylated in vivo, a possible formation of FTY720-P was examined in fibroblasts. Indeed, a partial phosphorylation could be detected. This explains the missing apoptotic effect of FTY720 at a concentration of 1 µM. But it lacks an explanation of the missing antiapoptotic effect. Utilization of SphK2-siRNA underlines the importance of the phosphorylation, as silencing of SphK2 led to a significant induction of apoptosis already at a concentration of 1 µM. Application of FTY720 results in a creation of an equilibrium consisting of both states of phosphorylation which counteract each others actions. At higher concentrations the cytotoxic effects prevail, though. As FTY720-P transmits its effects via S1P receptors, the involved receptors were examined. Experiments with the S1P1 specific agonist SEW2871 and the antagonists VPC23019 and suramin indicate that the S1P3 receptor subtype is crucial for mediating the effects. This could be confirmed by using S1P3 receptor knockout fibroblasts and keratinocytes. In further experiments the signalling pathway of the antiapoptotic effects of FTY720-P in fibroblasts was to be identified. The points of interest were the predominant proteins PI3K / Akt, ERK1/2 and mTOR. Although a phosphorylation of these proteins could be detected after stimulation with FTY720 or its phosphate, these pathways could be excluded. One reason were the specific inhibitors of the regarding pathways lacking any effect in apoptosis experiments. Another reason was a pronounced phosphorylation of the signalling proteins in S1P3 knockout fibroblasts. Utilization of the fluorescence dye JC-1 revealed the first difference between FTY720-P and its parent compound. The phosphate was able to stabilize the mitochondrial membrane potential, whereas FTY720 was not. In keratinocytes an involvement of mitochondria could be demonstrated, too. Furthermore, the S1P3 receptor subtype was identified as crucial, because FTY720-P could not provoke a stabilization of Δψm in S1P3 deficient fibroblasts anymore. Bcl-2 was tested as another member of proteins playing a role in the intrinsic pathway of apoptosis. Stimulation of fibroblasts with FTY720-P caused a strong phosphorylation of Bcl-2. Interestingly, FTY720 was not able to mimic these effects. Moreover, in S1P3 knockout fibroblasts no phosphorylation of Bcl-2 could be triggered anymore. The obtained results clearly emphasize the ambivalent function of FTY720. As the apoptotic effect is more likely to be mediated by a mechanism independent of S1P receptors, a more thorough examination of this part is desirable. In addition, the intracellular antiapoptotic signalling pathway needs to be completely clarified. Another aspect of this study was to examine the interaction of S1P and insulin regarding apoptosis in keratinocytes more closely. It is already known that S1P inhibits insulin induced proliferation in human keratinocytes. An activation of PKCδ an subsequent inhibition of Akt phosphorylation was identified as the underlying mechanism. In this study the formerly reported antiapoptotic potential of S1P in keratinocytes was confirmed. At the same time S1P decreased the antiapoptotic effect of insulin. An involvement of PKCδ in this action could be proved by using the activator of PKC, TPA. This compound mimicked the effects of S1P on insulin. In addition, experiments with siRNA against PKCδ revealed this isoform to be essentially involved in the interference of S1P and insulin. By using siRNA the apoptotic action of S1P was blocked so that only the antiapoptotic effect was visible. This proves that S1P possesses different properties depending on the surrounding system. This interesting behaviour suggests a possible positive outcome in the treatment of hyperproliferative diseases. It is widely accepted that TGF-β and estradiol have a positive effect on the migration of breast cancer cells and therefore promote metastasizing of tumours. But it has been reported that preincubation with estradiol inhibited TGF-β induced migration of MCF-7 cells. In this study these experiments could be repeated successfully along with the already reported induction of ERK1/2 phosphorylation and Smad repression. Moreover, these effects could also be provoked in MCF-7 cells by using the membrane impermeable E2-BSA. In addition, activation of ERK1/2 led to the inhibition of Smad. This was proved by using the MAPK inhibitor U0126. When this pathway was blocked, cells were able to migrate to TGF-β stimulation despite the desensitization by estradiol. A similar effect was observed after treatment with PTX. By using PTX and E2-BSA a possible involvement of membrane bound receptors in the E2 mediated effects was demonstrated. The fluorescence experiments for determination of the localization of the GPR30 receptor revealed a co-localization with the endoplasmic reticulum. The relevance of these findings along with the involvement of membrane bound receptors remains controversial and needs to be clarified in the future. Based on an unambiguous prove of GPR30 to be essential, the development of specific drugs for the treatment of breast cancer would be of great importance.
