Die Rolle des Transkriptionsfaktors AP-1 bei der Ceramid-induzierten Apoptose in der humanen Keratinozytenzellinie HaCaT

Abstract

Ceramid ist das zentrale Molekül im Sphingomyelin-Zyklus. Es wirkt als intrazellulärer Botenstoff (Second Messenger) und bewirkt Proliferationshemmung, Apoptose und Induktion der Differenzierung als zelluläre Antwort [Geilen et al., 1997a]. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Ceramid auf Proliferation, Apoptose und Expression Apoptose-assoziierter Gene in humanen Keratinozyten in serumfreiem Medium untersucht. Da natürliche langkettige Ceramide nur schwer in die Zelle gelangen können, wurden kurzkettige Ceramid-Analoga verwendet. Diese sind menbrangängig und verursachen in der Zelle die gleiche biologische Wirkung wie ein Anstieg von natürlichem intrazellulären Ceramid. Als Zellkulturmodell diente die humane Keratinozytenzellinie HaCaT. Zuerst wurde die Wirkung des Ceramid-Analogons C2-Ceramid auf Proliferation und Apoptose in HaCaT-Zellen in serumfreiem Medium untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß C2-Ceramid in HaCaT-Zellen konzentrationsabhängig antiproliferativ ist und Apoptose induziert. Gleichzeitig wurde demonstriert, daß das in der Literatur als biologisch inaktiv beschriebene Ceramid-Analogon Dihydroceramid ebenfalls, wenn auch in viel geringerem Maße als C2-Ceramid, antiproliferativ und apoptotisch in HaCaT-Zellen wirkt und deshalb nur eingeschränkt in diesem System als Negativkontrolle verwendet werden kann. Im Folgenden wurde der Effekt von C2-Ceramid (30 µmol/l) auf die Expression verschiedener Apoptose-assoziierter Gene mittels RT-PCR untersucht. Proteine wie das pro-apoptotische Bax und das anti-apoptotische Bcl-2 spielen in der Apoptose auf mitochondrialer Ebene eine zentrale Rolle. Obwohl eine geringe Erhöhung der bcl-2-Expression bei gleichbleibender bax-Expression gemessen werden konnte, verhinderte dies nicht die Ceramid-induzierte Apoptose. Veränderungen der Expression von p53, einem Gen, das an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt ist, konnten nicht gemessen werden. Die Expression von c-myc, das als Transkriptionsfaktor ebenfalls in den Zellzyklus eingreift, war zu allen drei Meßzeitpunkten geringfügig erhöht. Deutliche Ceramid-induzierte Genexpressionsänderungen waren bei den Genen c-jun und c-fos zu verzeichnen. Ihre Genprodukte bilden zusammen den Transkriptionsfaktor AP-1. Innerhalb von 24 h stieg die Expression von c-jun bis auf das 5 fache der Kontrollen an. Die Expression von c-fos verhielt sich dazu entgegengesetzt und sank nach 24 h bis unter die Hälfte gegenüber den Kontrollen. Dies macht deutlich, daß eher c-Jun und nicht c-Fos an der Bildung des Transkriptionsfaktors AP-1 in diesem System beteiligt ist. Um die Hinweise auf eine Ceramid-vermittelte Induktion von AP-1 zu bestätigen, wurde die Bildung und Aktivität von AP-1 mittels eines Transaktivierungsassays verifiziert. Die AP-1-Aktivität wurde nach 24stündiger Inkubation mit C2-Ceramid auf das 8 fache der Kontrollen induziert. Auf diese Weise konnte die Beteiligung des Transkriptionsfaktors AP-1 an der Ceramid-induzierten Apoptose auf funktioneller Ebene sowie an der Expression Differenzierungs- und Apoptose-assoziierter Gene in Säugern bestätigt werden. Damit wurde im Rahmen dieser Arbeit eine erste direkte Verbindung zwischen einem intrazellulären Ceramidanstieg und der Zellproliferationshemmung und Einleitung der Apoptose gefunden. Diese Verbindung schließt die Signalkaskade zwischen der antiproliferativen und apoptotischen Wirkung von Vitamin D3 auf Keratinozyten, die wir kürzlich nachweisen konnten [Geilen et al., 1997b]. Es ergibt sich folgendes Bild: 1?,25-Dihyroxyvitamin D3 -> TNF? -> Ceramid -> AP-1 -> Hemmung der Zellproliferation und Einleitung der Apoptose.

Ceramide, representing the central molecule in the sphingomyelin cycle, serves as a second messenger for cellular functions ranging from proliferation and differentiation to growth arrest and apoptosis [Geilen et al., 1997a]. In the present study the effect of ceramide on proliferation, apoptosis and expression of apoptosis related genes was investigated in human keratinocytes in serum-free medium . Because natural long-chain ceramides poorly penetrate the cell membrane, short-chain ceramide analogues were used which mimic the effects of natural intracellular ceramides. The human keratinocyte cell line HaCaT served as cell culture system. First the effect of the ceramide analogue C2-ceramide on proliferation and apoptosis of HaCaT cells was tested in serum-free medium. The results showed that C2-ceramide inhibits cell proliferation and induces apoptosis in a concentration dependent manner. Moreover it could be demonstrated that the biologically inactive ceramide analogue C2-dihydroceramide was also able to induce apoptosis and to inhibit cell proliferation in HaCaT cells, but to a much lesser extent. Furthermore the effect of C2-ceramide (30 µmol/l) on the expression of several apoptosis-related genes was investigated using RT-PCR. At the mitochondrial level proteins like Bax which is pro-apoptotic and Bcl-2 which is anti-apoptotic play a major role in apoptosis. Although we measured a slightly elevated bcl-2-expression and a concurrent unaltered bax-expression, ceramide-induced apoptosis was not prevented. The expression of p53 which is involved in controlling the cell cycle, was unchanged. The expression of c-myc, a transcription factor which is likewise involved in control of cell cycle, was slightly elevated after 2 h, 6 h and 24 h. c-fos and c-jun encoding two subunits of the transcription factor AP-1 (activating protein-1) showed distinct changes in gene expression. The expression of c-jun was induced within 24 h up to a 5-fold increase. In contrast c-fos was downregulated after 24 h to 50 % of the control. These data suggest that c-Jun rather than c-Fos contributes to the formation of AP-1 in this system. In order to prove the formation and activation of AP-1 and to confirm ceramide-mediated induction of AP-1, transactivating-assays were carried out. After 24 h incubation with C2-ceramide a 8-fold increase of AP-1-activity was observed. In conclusion the participation of AP-1 in cermide-induced apopotosis could be established on a functional level. These data confirm that transcription factor AP-1 regulates the expression of differentiation and apoptosis related genes in mammals and the proof for a direct link between an increase of intracellular ceramide and the inhibition of cell growth as well as induction of apoptosis could be presented. These findings complete the signalling pathway of vitamin D3 which we previously showed to inhibit cell growth and to induce apoptosis in keratinocytes [Geilen et al., 1997b]. In summary the following possible signal transduction pathway can be concluded: 1?,25-dihyroxyvitamin D3 -> TNF? -> Ceramide -> AP-1 -> inhibition of cell growth and induction of apoptosis.