Alanine-Scanning der Coredomäne des Immediate-Early-2-Proteins des humanen Zytomegalievirus

Abstract

Das IE2-Protein von HCMV ist ein essenzielles Schlüsselprotein in der immediate early-Phase des HCMV-Replikationszyklus. Als solches war es Gegenstand einer Vielzahl von Experimenten zur Aufklärung seiner Struktur und Funktionsweise. Neben der Transaktivierung von viralen und zellulären Promotoren sind eine repressive Wirkung auf den MIE- Promotor, eine Beeinflussung des Zellzyklus im Sinne eines Arrests der zellulären DNA- Replikation am G1/S-Übergang und eine direkte Bindung an eine als CRS bezeichnete DNA-Sequenz bekannt. Zudem werden Interaktionen mit pRB, p53 und dem viralen pUL84 beschrieben. Auch ein antiapoptotischer Effekt ist bekannt. Trotzdem ist es bisher, mit Ausnahme der Transaktivierung, nicht gelungen, Mutanten zu finden, in welchen nur einzelne der bekannten Funktionen ausfallen, während die übrigen unbeeinträchtigt bleiben. Um solche Mutanten zu finden, schien insbesondere die Core-Domäne ein vielversprechendes Ziel für weitere Mutationsstudien zu sein. Die vorangehenden Arbeiten von Asmar et al. hatten für diese etwa 100 AS umfassende Region im C-Terminus des Proteins gezeigt, dass hier auch relativ subtile Substitutionsmutationen zu einem vollständigen Verlust aller untersuchten Funktionen führen. Viele bisher publizierte IE2-Mutanten, sowohl experimentell erzeugte, als auch solche, die in verschiedenen Virusstämmen vorkommen, weisen in diesem Bereich Veränderungen auf. Gleichzeitig ist dieser Bereich allerdings zwischen den IE2 homologen Genen verschiedener Betaherpesviren hoch konserviert. Diskriminierende Proteinmutanten können ein wichtiges Hilfsmittel sein, um die Bedeutung einzelner Proteinfunktionen im Kontext der viralen Replikation und der Virus- Wirt-Interaktionen zu evaluieren. Auf lange Sicht versprechen Sie die Identifikation potenzieller Angriffspunkte von neuen antiviralen Wirkstoffen. Darüberhinaus lassen sich aus Mutationsstudien auch Hinweise auf die Proteinstruktur ableiten, die im Fall von IE2 noch unbekannt ist. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit eine systematische Mutationsanalyse der IE2 -Core-Domäne vorgenommen werden. Hierzu wurden auf Basis ihres Konservierungsgrades 52 geeignete Kandidaten aus den Aminosäuren des Core- Bereich ausgewählt. Für diese wurden Expressionskonstrukte erstellt und die mutierten IE2-Proteine in viruspermissiven Zellen exprimiert, wobei nicht alle Mutanten das Expressionsniveau von Wildtypprotein erreichten. Unter den IE2-Funktionen wurden sowohl die Transaktivierung, als auch Autorepression, Zellzyklusarrest und DNA-Bindungsfähigkeit in bereits im Labor etablierten experimentellen Systemen untersucht. Die hier gewonnen Daten ergaben ein differenzierteres Bild der Core-Domäne. Im Bereich der AS 524–536 zeigten die Substitutionen einen Effekt, der weitestgehend dem der Deletion des gesamten C-Terminus entsprach. Auch der Bereich AS 498–504 stellte sich als sensibles Cluster dar. Im Gegensatz dazu zeigten die Mutanten im Bereich AS 506–523 nur moderate Effekte im Vergleich zu Wildtyp-IE2. Unter den untersuchten Funktionen erschien der Zellzyklusarrest am unempfindlichsten gegenüber Einzelpunktmutationen im Core-Bereich. In den Experimenten zur DNA-Bindung zeigten sich die deutlichsten Effekte. Interessanterweise zeigten nicht alle Mutanten mit Autorepressionsfunktion eine intakte DNA-Bindung. Die teilweise deutlich unter Wildtypniveau liegenden Expressionsniveaus einzelner Mutanten, lassen sich möglicherweise durch Fehlfaltung erklären. Diese Deutung legt, ebenso wie die Analyse von in silico-Strukturanalysen, eine strukturell wichtige Rolle vieler Reste in der Core-Domäne nahe. Demnach wäre die Core- Domäne an der Ausbildung eines hydrophoben Proteinkerns beteiligt. Außerdem ergaben sich aus den Ergebnissen Anhaltspunkte für eine direkte Beteiligung von Seitenketten der Core-Domäne an – wahrscheinlich unspezifischen – IE2-Protein- Interaktionen. Eine diskriminierende IE2-Mutante, im Sinne eines vollständigen Verlusts nur einzelner Funktionen, fand sich unter den getesteten Substitutionen nicht. Dennoch erbrachte die vorliegende Arbeit eine Fülle von Informationen über die C-terminale Core-Domäne des IE2-Proteins. Die gründliche Interpretation dieser Daten, auch in Zusammenhang mit rechnergestützten Strukturvorhersagen, zeigt Ansatzpunkte für die weitere Erforschung dieses wichtigen HCMV-Proteins auf.

The IE2 protein of HCMV is an essential key protein in the immediate early phase of the HCMV replicative cycle. As such it has been subjected to a multitude of experiments to the discovery of its structure and functions. Besides the transactivation of viral und cellular promoters, the arrest of cellular DNA replication at the G1/S transition and a direct binding of a DNA sequence designated crs, are known. Moreover interactions with pRB, p53 and the viral pUL84 have been described. It also has an antiapoptotic effect. Nevertheless, with the exception of transactivation, no mutants could be determined with loss of single functions, leaving the others intact. To find such mutants, especially the core domain appeared to be a worthwhile target for further mutation studies. Preceding works of Asmar et al. had shown that this region of about 100 aa in the c-terminus of the protein was vulnerable to relatively subtle mutations, leading to a total loss of functions of all functions examined. Many already published IE2 mutants, whether created experimentally or occurring in different virus strains, showed changes in this region. At the same time, this area is highly conserved between the IE2 homologues of different beta herpesviruses. Discriminating protein mutants can be of great value to determine the significance of single protein functions in the context of viral replication und virus host interactions. On the long term they promise the identification of new potential antiviral drug targets. Moreover the mutational studies can give hints on the protein structure, which in case of IE2 is still unknown. Because of this, in the present work, we wanted to perform a systematic mutational analysis of the IE2 core domain. To achieve this 52 suitable candidates where chosen from the amino acids of the core domain on the basis of their conservation. Expression constructs were created for these and mutant IE2 was expressed in permissive cells. Not all mutants reached the expressional level of wildtype IE2. Amongst the IE2 functions transactivation as well as autorepression, cell cycle arrest and DNA binding activity where assayed using methods already established in the lab. The data resulted in a more differentiated view of the core domain. In the area of aa 524-536 the substitutions showed an effect similar to the deletion of the whole c-terminus. Also the area of aa 498-504 appeared as a sensitive cluster. In contrast mutants in the area of aa 506-523 showed only moderate effects compared to IE2 wildtype. Amongst the examined functions the cell cycle arrest appeared most resistant to single point mutations in the core domain. The experiments regarding DNA binding showed the most dramatic effects. Interestingly not all mutants capable of autorepression showed intact DNA binding. The partly drastically reduced expression levels of single mutants compared to wildtype expression, can possibly be explained by incorrect protein folding. This, as well as the analysis of in-silico structure prediction, would suggest a structurally important role of many residues in the core domain. Accordingly the core domain would be involved in the formation of a hydrophobic protein core. In addition the results suggest a direct involvement of side chains of the core domain in – probably unspecific – IE2 protein interactions. A discriminating mutant, in the sense of a total loss of only a single function, was not found amongst the tested substitution mutants. Nevertheless the present work yielded a multitude of information regarding the c-terminal core domain of IE2. A thorough interpretation of this data, also with the addition of computer assisted structure prediction, gives hints for further research on this important HCMV protein.