Einfluss verschiedener GDF5- und BMP2-Mutationen auf ausgewählte molekulare Mechanismen der Chondrogenese und Osteogenese

Abstract

Die Bone morphogenetic proteins (BMPs) und Growth and differentiation factors (GDFs) regulieren während der Embryogenese und im adulten Organismus die Proliferation, Differenzierung und Migration verschiedener Zelltypen. Die Vielfalt der Prozesse, an denen BMPs/GDFs beteiligt sind, kann nur durch eine sehr genaue Regulation der Expression von Liganden, Rezeptoren sowie Antagonisten bewältigt werden. Bereits geringe Abweichungen führen zu Störungen des vaskulären Systems, rufen Krebs hervor oder haben Skelettfehlbildungen zur Folge. Die Mutation GDF5-S94N wurde in Patienten mit dem Multiplen Synostose Syndrom (SYNS) identifiziert. Die Betroffenen leiden unter Symphalangismus, karpale/tarsale Fusionen, Gehörlosigkeit und Fehlbildungen des Gesichts. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Mechanismen dieser Erkrankung aufgeklärt und GDF5-S94 als essentielle Aminosäure für die Interaktion mit den BMP Typ II-Rezeptoren und Noggin identifiziert. Die Mutation GDF5-S94N liegt in der Typ II-Rezeptor- Bindungsstelle des GDF5 und verringert die Affinität zu den BMP Typ II- Rezeptoren. Dies verringert die Aktivierung des Smad-abhängigen und des p38 MAPK Signalweges und beeinträchtigt die Chondrogenese der ATDC5-Zellen. Zusätzlich schwächt die Mutation GDF5-S94N auch die Bindung zum BMP/GDF- Antagonisten Noggin. GDF5-S94N kann von Noggin nicht optimal gebunden werden und ist somit gegen die Inhibierung durch Noggin resistent. Die Inkubation von murinen Micromass-Kulturen mit GDF5-S94N zeigte, dass die geringe biologische Aktivität des GDF5-S94N trotzdem ausreicht, um die Chondrogenese und Expression von Noggin zu induzieren. In Gegenwart von Noggin wird die durch GDF5-S94N-induzierte Chondrogenese nicht wie im Fall des GDF5 durch eine negative „feedback“-Hemmung inhibiert, sondern kann ungehindert voranschreiten. Der übermäßigen Chondrogenese folgen Osteogenese und Mineralisierung, die sich in der Verknöcherung knorpeliger Elemente und Gelenkspalten und so im Phänotyp SYNS äußern. Des Weiteren konnte hier gezeigt werden, dass die stark reduzierte chondrogene Differenzierung, die durch die BDA2-auslösende Mutante GDF5-L60P induziert wird, durch die fehlende Aktivierung von Smad 1/5/8 und p38 MAPK verursacht wird. Durch BMP2-Mutanten wurden außerdem die Einflüsse der Ligand-Rezeptor-Affinität auf die Signaltransduktion und das osteogene Potential von BMP2 untersucht. Die Mutation BMP2-L51P zeigte, dass ohne die Bindung an BMPRI die Aktivierung der R-Smads sowie die Bildung des BISC und die Aktivierung der „Non- Smad“-Signalwege nicht möglich sind. Die verstärkte Bindung der BMP2-L51P/S85R /A86P-Mutante an BMPRII ermöglicht die Bindung an den PFC und induziert eine stark reduzierte transkriptionelle Aktivität, die jedoch für die Transdifferenzierung von C2C12-Zellen zu Osteoblasten nicht ausreicht. Die Mutanten BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D hingegen verbessern aufgrund der unveränderten Affinität zu den Typ I-Rezeptoren und der höheren Affinität zu den Typ II-Rezeptoren die Aktivierung von Smad 1/5/8 und p38 MAPK und fördern so die Differenzierung zu Osteoblasten und ihre Mineralisierung. Anders als BMP6 werden die Superagonisten BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D durch Noggin inhibiert. Da die Mutanten zudem auf der Struktur des für die Frakturheilung nötigen BMP2 basieren, scheinen BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D gut als Wirkstoffe für regenerative Therapien geeignet zu sein. Eine übermäßige Knochenbildung sollte durch ihre Interaktion mit Noggin verhindert werden.

Bone morphogenetic proteins (BMPs) and the Growth and differentiation factors (GDFs) regulate a plethora of different cellular processes such as proliferation, differentiation and migration of several cell types during embryonic development and in the adult organism. This requires fine-tuning of the expression of the ligands, the BMP receptors and the antagonists. Aberrant BMP signalling results in the development of vascular disorders, cancer or malformation of bone and cartilage. This thesis describes the molecular mechanisms of GDF5-S94N mutant causing the Multiple Synostoses Syndrome (SYNS). Patients suffer from symphalangism, carpal/tarsal fusions, deafness and mild facial dysmorphism. GDF5-S94 is located within the BMPRII interaction site. S94 is identified as an amino acid which is crucial for the interaction with the BMP receptor type II and the BMP antagonist noggin. Therefore, GDF5-S94N exhibits impaired binding to the type II receptors causing alleviated Smad- and non-Smad signalling and reduced chondrogenic differentiation of ATDC5 cells. Furthermore, the mutation GDF5-S94N results in a reduced affinity of the ligand to the BMP/GDF antagonist noggin and the consequential lack of noggin inhibition. Analysing chondrogenesis of mouse micromass cultures revealed that despite reduced signalling capacity GDF5-S94N is still able to induce chondrogenesis and the expression of noggin. In contrast to GDF5 wildtype, GDF5-S94N is not inhibited by increasing concentrations of endogenous noggin in a negative feedback inhibition. It exceeds the GDF5 wildtype action and signals over prolonged time which results in enhanced endochondral ossification and the phenotypic outcome of SYNS. In addition, it was shown that reduced chondrogenic differentiation in patients suffering from brachydactyly A2 due to mutation GDF5-L60P is caused by lack of Smad signalling and p38 MAPK activation. Furthermore, in this thesis BMP2 mutants were used to analyse the impact of modified receptor binding affinities on BMP signalling and osteogenic differentiation. As it is shown by incubation with BMP2-L51P, failed interaction with BMPRI prevents activation of Smad-dependent and Non-Smad signalling. Stimulation with BMP2-L51P/S85R/A86P, which additionally exhibits an enhanced affinity to BMPRII, phosphorylates Smad 1/5/8 through PFCs and induces a markedly reduced, but detectable transcriptional activity. However, p38 MAPK is not activated. Therefore, the residual Smad-dependent target gene transcription is not sufficient to induce transdifferentiation of C2C12 cells to osteoblasts. BMP2-S85R/A86P und BMP2-L100K/N102D mutants bind BMPRI with the same affinity, but the type II receptors with an increased affinity compared to BMP2. The mutants improve the activation of Smad-dependent and Smad-independent signalling and enhance osteogenic differentiation and mineralisation. In contrast to BMP6, signalling induced by BMP2-S85R/A86P and BMP2-L100K/N102D muteins is inhibited by noggin. Since BMP2 is indispensable for fracture healing and the superagonists BMP2-S85R/A86P and BMP2-L100K/N102D have a similar structure to BMP2, they are attractive candidates for therapeutic applications in the field of regenerative medicine. Malformations caused by enhanced osteogenesis should be prevented by interaction of BMP2-S85R/A86P and BMP2-L100K/N102D with noggin.