Vom Genom zum Proteom: Genetische und Physikalische Kartierung von Gehirnproteinen der Maus

Abstract

Untitled Document ZUSAMMENFASSUNG

Mit der Totalsequenzierung des Genoms eines Organismus und der Identifizierung der kodierenden Sequenzen kann - im Prinzip - jedes Protein des betreffenden Organismus seinem Strukturgen zugeordnet werden, wenn genuegend Information ueber die Primaerstruktur (Aminosaeuresequenz, Peptidmassen) der Proteine vorliegt. Ungeklaert dabei bleibt jedoch, inwieweit ein Protein ueber sein Strukturgen hinaus von anderen kodierenden DNA-Sequenzen abhaengig ist. Das sind Gene, die auf die Modifikation und Expression der Proteine Einfluss nehmen koennen. Unter dieser Fragestellung wurde in der vorliegenden Arbeit mit genetischen Methoden eine umfangreiche Kartierung von Proteinen der Maus durchgefuehrt. Die Untersuchung der Gehirnproteine der beiden Maeusespezies Mus musculus und Mus spretus durch hochaufloesende zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) in der Arbeitsgruppe Prof. J. Klose (Klose 1999b) hatte zum Nachweis von 1324 qualitativen oder quantitativen Proteinpolymorphismen innerhalb einer Gesamtzahl von etwa 8700 Proteinspots gefuehrt. Im Rahmen einer europaeischen Kooperation (The European Collaborative Interspecific Backcross; EUCIB) wurde mit den Maeusespezies Mus musculus und Mus spretus eine Feinkartierung des Genoms der Maus auf der Basis von DNA-Polymorphismen von etwa 1000 Rueckkreuzungstieren durchgefuehrt. Die durchschnittliche Markerdichte betrug 0.61cM. Die Kartierung von 1324 Proteinpolymorphismen auf der genetischen Karte der Maus in dieser Arbeit basierte auf den Ergebnissen der Analyse der Polymorphismen in 2D-Gelen von 64 Rueckkreuzungstieren der EUCIB-Kreuzung. Da viele der 64 Rueckkreuzungstiere innerhalb des EUCIB-Projektes nur unzureichend mit Mikrosatellitenmarkern genotypisiert worden waren, wurden in dieser Arbeit zunaechst IRS-PCR-Marker eingesetzt, um die Markerdichte zu erhoehen. Dies diente dazu, die Rekombinationen in den 64 Rueckkreuzungstieren vollstaendig zu erfassen und fuer die Proteinkartierung nutzbar zu machen. IRS-PCR-Marker sind Marker, die ohne jede Sequenzinformation eingesetzt werden koennen. Sie werden mit einem einzigen Primer, hier dem Primer B1R fuer das repetitive SINE-Element B1 der Maus, gewonnen. IRS-PCR-Produkte von genomischer DNA von Mus musculus, die einen quantitativen Polymorphismus zwischen Mus musculus und Mus spretus aufwiesen, wurden zur Genotypisierung von bis zu 300 Rueckkreuzungstieren der EUCIB-Rueckkreuzung verwendet. Die Integration von 70 IRS-PCR Markern und 9 Mikrosatellitenmarkern in das Ankermarkergeruest aus 90 DNA-Markern des EUCIB-Projektes bot ein dichtes Netz von Markern und damit eine wesentlich verbesserte Ausgangslage fuer die Positionierung der Proteine auf der genetischen Karte der Maus. Mit dem Programm MAPMAKER/EXP 3.0 wurde aus DNA- und Proteinpolymorphismen eine genetische Karte erstellt. Die Ergebnisse zeigten: Von 1324 polymorphen Proteinspots konnten 664 Spots genetisch kartiert werden. Spotserien, die gleiche Vererbung und gleichen Variationstyp zeigten, wurden unter demselben Variantennamen zusammengefasst und als 'homogene Spotfamilie' bezeichnet. Die 664 kartierten Spots stellen demnach 409 Varianten dar. Von diesen konnten 360 auf den Chromosomen positioniert oder zumindest Regionen zugeordnet werden. Als Grenzwert fuer die Anordnung der Proteine auf einem Chromosom galt ein LOD-Wert von 2,5. 49 Varianten zeigten nur geringe, jedoch

signifikante Kopplung (LOD-Wert groesser 3) an einzelne Marker der Chromosomenenden und konnten daher zumindest einem Chromosom zugeordnet werden. Mit dem hier verwendeten genetischen Verfahren der Kartierung mendelnder Merkmale liessen sich nur monogen bedingte Polymorphismen kartieren. Die nicht positionierten, nur schwache Kopplung zeigenden 49 Varianten sowie die andere Haelfte (660 Spots) der 1324 Polymorphismen, die nicht zur Kartierung eingesetzt werden konnten, liessen sich offenbar deswegen nicht kartieren, weil diese Proteine polygen determiniert waren. Die Polymorphismen dieser Spots werden vermutlich von mehr als nur einem - dem Strukturgenlocus - determiniert. Um herauszufinden, welche Proteine die 664 kartierten Spots oder 409 Varianten darstellen, bestand der zweite Schritt nach der Kartierung in der Identifizierung der kartierten Proteinspots durch Massenspektrometrie. Das Ziel hierbei war, Spotfamilien zu erkennen, d.h. die Isoformen eines Proteins zu finden. Insgesamt wurden bisher etwa 200 polymorphe Proteinspots identifiziert. Neben den genannten homogenen Spotfamilien konnten bisher 25 heterogenen Spotfamilien gefunden werden. Eine heterogene Spotfamilie enthaelt Spots, die als dasselbe Protein identifiziert wurden, aber unterschiedliche Polymorphismen aufweisen. Die genetische Analyse zeigte, dass einige der polymorphen Spots auf die genetische Position des identifizierten Strukturgenortes kartierten, waehrend andere polymorphe Spots auf einen anderen chromosomalen Locus kartieren. Diese Kartierungspositionen zeigen offenbar Protein-modifizierende oder -regulierende Gene an. Die identifizierten Proteine konnten folgenden Gruppen zugeordnet werden: 103 Proteinspots gehoerten 70 Proteinen an und erwiesen sich als neue Kartierungen in der Maus. 20 Proteine waren bereits kartiert worden und unsere Kartierung stimmte mit der bekannten Kartierungsposition ueberein. Diese Proteinpolymorphismen wurden als Strukturgen-bedingte Polymorphismen gewertet. Sie beruhen auf verschiedenen Allelen des Gens in den beiden Mausstaemmen. Eine dritte Klasse bildeten 21 Polymorphismen, die abweichend von der bisher bekannten Kartierungsposition in der Maus oder der des menschlichen Orthologs kartierten. Zum Beispiel gehoeren Spots der heterogenen Spotfamilie des Proteins 'Gamma-Enolase' zu allen drei genannten Klassen: vier Mobilitaets- Varianten kartieren auf die bekannte Position des Gens fuer Gamma-Enolase auf Chromosom 6, zwei auf weitere unterschiedliche Positionen auf Chromosom 6 und eine auf Chromosom 15, auch ein nicht-varianter Spots wurde identifiziert, der ein kleineres Molekulargewicht zeigt und wahrscheinlich ein Fragment darstellt, das die Mutation verloren hat. Auf Einzelspotebene sind 70% der mit Massenspektrometrie identifizierten polymorphen Spots strukturgenbedingt, waehrend 30% der Polymorphismen durch einen Modifikator- oder Regulatorgenort verursacht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die cytosolische Fraktion der Gehirnproteine untersucht. Zur weiteren Untersuchung liegt die Membranfraktion vor. Ferner wurden von den gleichen Rueckkreuzungstieren der EUCIB-Kreuzung auch die Organe Leber, Herz, Niere und Muskel entnommen. Die genetische Analyse wurde inzwischen auf die Organe Leber und Herz ausgeweitet. Die 2DE-Muster zeigten, dass viele Proteine in mehreren oder allen Organen auftreten. Die genetische Untersuchung dieser Proteine wird zeigen, ob der Effekt von Protein- modifizierenden und -regulierenden Genen wesentlich zur Organspezifitaet der Proteine beitraegt.

Untitled Document SUMMARY

After completing genome sequencing of organism and after identification of the coding sequences virtually every protein of the organism can be assigned to its structural or coding gen, provided enough information exists about the primary structure of the protein (amino acid sequence, (e.g. tryptic) peptide masses). Unknown stays yet to which extend the appearance of a protein depends on its gen and to which extend it depends on further coding DNA-sequences. These are genes, that influence expression or modification of other proteins. In respect of these questions about regulation and modification we performed genetic mapping of polymorphic proteins in the mouse. The investigation of brain proteins of the two mouse species Mus musculus and Mus spretus with high resolution two-dimensional electrophoresis had revealed 1324 quantitative or qualitative protein polymorphisms out of a total number of 8700 cytosolic proteins (Klose 1999b). An European Collaborative Interspecific Backcross project (EUCIB) was founded for high resolution mapping of the mouse genome, based on 1000 backcross animals from the two species Mus musculus and Mus spretus. DNA-markers were spaced 0.61cM on average. The mapping of 1324 protein polymorphisms on the genetic map of the mouse was based on the analysis of the polymorphisms in 64 of the 1000 backcross animals of the EUCIB cross. Because a part of the 64 backcross animals were not sufficiently genotyped with DNA-markers, we started with using additional markers based on IRS-PCR to substantially increase the marker density as a prerequisite for mapping the protein polymorphisms. This aimed at fully revealing the existing recombinations in all of the 64 backcross animals and utilizing them for the mapping of polymorphic proteins. IRS-PCR markers were used because they can be used without knowing any genomic sequence information. They are generated using a single primer, e.g. the primer B1R for the repetitive SINE-element B1 of the mouse. IRS-PCR products of genomic DNA from Mus musculus revealing a quantitative polymorphism between Mus musculus and Mus spretus were used here for genotyping of up to 300 backcross animals from the EUCIB cross. The integration of 70 IRS-PCR markers and 9 microsatellite markers in the markerframework of 90 anchor markers provided by EUCIB established an improved, sound framework for positioning of the polymorphic proteins on the genetic map of the mouse. The software MAPMAKER/EXP 3.0 was used to build a genetic map out of DNA- and protein polymorphisms. The results showed: 664 of the 1324 polymorphic protein spots could be mapped on the genetic map of the mouse. Spots showing identical inheritence and the same type of variation were given the same name and defined as a 'homogeneous spot family'. The 664 mapped spots represented therefore 409 variants. 360 variants could be placed on the mouse chromosomes. As threshold for the ordering of protein polymorphisms between DNA-markers a logarithmic odds ratio of 2.5 was applied. 49 of the 409 variants showed only linkage to a chromosome. With the procedure used here for mapping polymorphisms based on mendelian inheritance we could only assess monogenetically caused polymorphisms. For the variants that showed linkage to a chromosome only as well as the 660 of the 1324 polymorphic spots that didn't show a mendelian segregation pattern at all, it can be concluded that the polymorphisms are caused by the effects of not only one but several genes. The polymorphisms of these spots are probably caused by additional loci

other than the protein coding gene locus itself. To find out which proteins are represented by the 664 mapped spots or 409 variants mass spectrometry was used to identify the spots. The aim was, to recognize spot families and to find all the isospots that represent the same protein. Until now about 200 protein spots could be identified. Next to spots belonging to homogeneous spot families mentioned above 25 heterogeneous spot families could be recognized. A heterogeneous spot family contains spots that are all identified as the same protein, but the single spots show different types of polymorphisms. The genetic analysis showed, that some of the polymorphic spots mapped to the known position of the coding gene whereas others mapped to an unexpected chromosomal location. These mapping positions reveal probably protein- modifying or regulating genes. The identified proteins belong to several different classes: 103 protein spots represented 70 proteins which were mapped newly in the mouse. 20 proteins had already been mapped and were confirmed in our approach. These polymorphisms were considered as based on coding gene polymorphisms, where the polymorphism reflects different alleles of the gene in the two mouse species. A third class contained 21 proteins that mapped differently from the known mapping position in mouse or the human orthologue. For example, spots of the heterogeneous spot family of 'Gamma Enolase' belong to all three classes: four mobility variants map to the known position of the 'Gamma Enolase' gen on chromosome 6, two variants map to different positions on chromosome 6, one on chromosome 15 and one spot is non-variant, probably due to loss of the coding-gene-based variation during degradation of the protein. Counting single spots that are identified by mass spectrometry 70% of the polymorphisms are based on the protein-coding gene whereas 30% can be lead back onto modifying or regulating gene locus. In the examination presented the cytosolic fraction of mouse brain was investigated. Further investigation on the membrane fraction and on several additional mouse tissues (liver, heart, kidney and muscle) will follow. The analysis of liver and heart proteins revealed already that the majority of spots overlap with spots also present in the brain 2D-pattern. The genetic analysis of the polymorphisms will show to which extend regulating and modificating loci are responsible for organ specificity of proteins.