Untersuchungen zu Sphingosin-1-Phosphat bei der epithelialen-mesenchymalen Transformation in humanen Keratinozyten

Abstract

Die epitheliale-mesenchymale Transformation (EMT) beschreibt einen Prozess, bei dem sich ruhende Epithelzellen aus ihrem Zellverband lösen und eine fibroblastenartige Gestalt annehmen, um nach Migration in entferntes Gewebe neue Strukturen aufzubauen. Eine bedeutende Rolle spielt die EMT während der embryonalen Entwicklung und der Wundheilung, aber auch bei fibrotischen Prozessen und der Metastasierung von Karzinomen. Der transformierende Wachstumsfaktor-β (TGF-β) wurde als bedeutender Regulator der EMT in einer Vielzahl von Zelllinien, aber auch in primären Zellen identifiziert. Der Lipidmediator Sphingosin-1-Phosphat (S1P), der lange Zeit nur als Strukturlipid betrachtet wurde, steuert ein weites Spektrum biologischer Prozesse einschließlich Zellmotilität, Ca2+-Freisetzung und Umstrukturierung des Zytoskeletts. Ähnlich wie TGF-β steigert S1P die Proliferation in Fibroblasten, hemmt dagegen das Wachstum in Keratinozyten und wirkt in beiden Zelltypen migratorisch. Als Auslöser der EMT ist S1P bislang nicht benannt worden, jedoch gibt es Hinweise auf eine transformatorische Wirkung des Sphingolipids in Epithelzellen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl TGF-β als auch S1P humane primäre Keratinozyten in einen fibroblastoiden Phänotyp transformieren. Dies ging mit einer Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts und einer Modulation des untersuchten Protein- und mRNA-Expressionsmusters einher. Die Expression des epithelialen E-Cadherins wurde gehemmt, während die mesenchymalen Proteine α-Glattmuskelaktin und Fibronektin verstärkt gebildet wurden. Die Matrixmetalloproteinasen MMP-2 und MMP-9, die nach Aktivierung die Basalmembran degradieren und den Zellen somit die Migration über die Extrazellulärmatrix ermöglichen, wurden interessanterweise unterschiedlich reguliert. Während MMP-9 durch TGF-β und S1P gleichermaßen verstärkt exprimiert wurde, steigerte nur TGF-β die MMP-2-Freisetzung. S1P dagegen senkte die TGF-β-induzierte MMP-2-Sekretion. S1P vermittelt den Großteil seiner Wirkungen über die membranständigen, G -Protein-gekoppelten Rezeptoren S1P1-5. Mittels Pertussistoxin ließ sich zeigen, dass alle untersuchten Parameter über G-Proteine der Gi-Familie reguliert wurden. Zur weiteren Charakterisierung der Rezeptorbeteiligung wurden die S1P-Agonisten SEW2871 und FTY720 eingesetzt. So konnte für S1P1 eine starke Beteiligung an der EMT gezeigt werden. Die Signalwege, über die TGF-β EMT auslöst, unterscheiden sich in Abhängigkeit vom zellulären Kontext. Häufig sind Smads bei Induktion der EMT involviert. Auf der anderen Seite wurde auch die Beteiligung Mitogen-aktivierter Proteinkinasen gefunden, eine bedeutende Rolle spielen hier die extrazellulär-regulierten Kinasen (ERK). Frühere Arbeiten unseres Arbeitskreises zeigten, dass auch S1P sowohl Smads als auch ERK in primären Keratinozyten aktivieren kann. Um die Relevanz des Smad-Signalwegs bei der EMT in den Keratinozyten zu ermitteln, wurde spezifische siRNA gegen das Co-Smad Smad4 eingesetzt. Die Beteiligung der ERK wurde durch Einsatz des ERK-Inhibitors PD98059 geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass die EMT in Keratinozyten durch TGF-β und S1P hauptsächlich über eine Kooperation des Smad- und des ERK-Signalwegs gesteuert wird. Von großer Bedeutung scheint auch das Zusammenspiel zwischen S1P und TGF-β zu sein, da die Kostimulation der Keratinozyten mit TGF-β und S1P in jeweils niedrigen Konzentrationen zu einer deutlichen Effektverstärkung führte.

In the process of EMT epithelial cells scatter because of loss of cell-cell junctions, adopt a fibroblastic phenotype and migrate into distinct tissues to build new structures. EMT occurs during embryonic development and wound healing, but was also shown in fibrosis and tumour progression. Transforming growth factor-β (TGF-β) has been identified as prominent regulator of EMT in a variety of cell lines as well as in primary cells. The lipid mediator sphingosine 1-phosphate (S1P), long time considered only as a structure lipid, influences a broad spectrum of biological processes including cell motility, Ca2+-release and reorganisation of the actin cytoskeleton. Similar to TGF-β, S1P enhances proliferation rates of fibroblasts, but significantly inhibits growth of human keratinocytes, whereas it acts as chemoattractant on both cell types. S1P has not been described as inducer of EMT so far, but there are hints at transformatory effects in epithelial cells by the sphingolipid. Here, the ability of TGF-β as well as S1P to induce a fibroblastic phenotype in human primary keratinocytes is shown. The transformation was accompanied by formation of actin stress fibres and a switch of the investigated protein and mRNA expression pattern. Thus, repression of the epithelial E-Cadherin and a strong induction of the mesenchymal proteins α-smooth muscle actin and fibronectin were found. Interestingly, the matrix metalloproteinases MMP-2 und MMP-9, which support invasion by degrading epithelial basement membrane and initiate migration through the extracellular matrix were regulated differently. While stimulation with TGF-β and S1P enhanced MMP-9 expression to a similar extent, MMP-2 secretion was increased by TGF-β only. In contrast, stimulation with S1P repressed the TGF-β-induced MMP-2 secretion. S1P mediates most of its effects via the G-protein coupled receptors S1P1-5. With pertussis toxin, dependency of modulation of all investigated parameters to G-proteins of the Gi-family was shown. To address the participation of specific receptors in EMT, cells were treated with the S1P-agonists FTY720 and SEW2871. Thus, a predominant involvement of S1P1 in EMT was shown. Depending on the cellular context there are several pathways to mediate the EMT in response to TGF-β. One common pathway involved in EMT is activation of the Smads. On the other hand there are also reports of mitogen-activated protein kinase pathways mediating EMT, mainly extracellular signal-regulated kinases (ERK). Previous findings of our team showed activation of Smads as well as ERK by S1P in primary keratinocytes. Using specific siRNA against the Co-Smad Smad4, participation of the Smad-pathway was investigated. To estimate the involvement of ERK, cells were treated with the ERK-inhibitor PD98059. Thus, EMT in human primary keratinocytes elicited by TGF-β and S1P was shown to be mediated by cooperation of Smad and ERK signalling pathways. The interaction between TGF-β and S1P seems to be very important since co-treatment of keratinocytes with TGF-β and S1P in low concentrations yielded strong effect amplification.