Entwicklung eines in-vitro Modells zur Verbesserung der Therapie einer Toxoplasmose

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es ein Testsystem zu entwickeln, in welchem die Wirkung und Wechselwirkung von Nanopartikeln in infizierten Zellkulturen gemessen werden konnte. Als Modellsystem dienten die Mäusemakrophagenlinie J774-A1 und GFP-transfizierte Toxoplasmen. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob die Therapie der Toxoplasmose durch an Träger gekoppelte Arzneistoffe verbessert werden kann. Mit dem Einsatz von Makrophagen, die in der Lage sind, arzneistoffbeladene Partikel durch Phagozytose aufzunehmen, wurde erhofft, dass dies zu einer intrazellulären Anreicherung des Arzneistoffs führen würde. Zur genauen Charakterisierung wurden einige wichtige physikochemische Parameter der Partikel untersucht. Ausgegangen wurde von nicht abbaubaren Polystyren-Nanopartikeln, die in der Literatur schon oft als Modellpartikel beschrieben wurden. Aus der Frage heraus, wie die Partikel als Arzneistoffträger fungieren sollten, wurde in dieser Arbeit mit Kern-Schale- Partikeln gearbeitet, bei denen der Arzneistoff (Spiramycin bzw. Pentamidin) in der Schale vorhanden sein sollte. Die Kern-Schale-Partikel, die hergestellt wurden, bestanden aus einem Polystyren-Kern und einer Polybutylcyanoacrylat- Schale. Die Bestimmung der Partikelgröße erfolgte durch die Photonenkorrelationsspektroskopie. Auch der Oberflächenladung, die durch die Messung des Zetapotentials bestimmt wurde, wird ein großer Einfluß auf die Aufnahme durch Zellen des RES beigemessen. Ein weiterer Parameter, der für die Aufnahme der Partikel durch Makrophagen des RES von Bedeutung ist, ist die Oberflächenhydrophobie. Hydrophobe Nanopartikel werden im Vergleich zu hydrophilen bevorzugt phagozytiert. Über hydrophobe Wechselwirkungen interagieren hydrophobe Partikel mit Serumproteinen (Opsonisierung), was zu einer erhöhten Partikelaufnahme durch Makrophagen führt. Bei der Charakterisierung der Nanopartikel stellte sich heraus, dass die Beladung mit Arzneistoffen keinen signifikanten Einfluss auf die untersuchten Parameter hatte. Die durchgeführten Untersuchungen zum enzymatischen Abbau von Polybutylcyanoacrylat zeigten, dass die Partikel innerhalb von 200 min abgebaut bzw. ausreichend verändert wurden, um die Arzneistoffe freizusetzen. Damit wurde sichergestellt, dass bei den Versuchen in der Zellkultur die Partikel innerhalb der dreitägigen Versuchsdauer die Arzneistoffe freigegeben. Durch die Bestimmung der verbleibenden Wirkstoffmenge im Dispersionsmedium frisch präparierter Partikel ließ sich die relative Beladungsrate der Partikel ermitteln. Es wurde gezeigt, dass bei den Partikeln sehr hohe Beladungsraten von über 95% erreicht wurden. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte in-vitro Modell ermöglichte es, die Infektion von Makrophagen mit Toxoplasma gondii und die Behandlung mit Nanopartikeln zu beobachten und auszuwerten. Ein infiziertes Zellkultursystem, in dem über mehrere Tage (das entspricht mehreren Zyklen der Parasitenvermehrung) die Wirkung von Nanopartikeln mit oder ohne Arzneistoff verfolgt werden kann, kommt einem Tiermodell schon sehr nahe und stellt somit eine wertvolle Ergänzung der Testsysteme dar. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS). Dadurch war es möglich, die Anzahlen der vorhandenen Makrophagen und extrazellulären Toxoplasmen zu bestimmen. Da sowohl die Toxoplasmen (grün) als auch die eingesetzten Nanopartikel (rot) fluoreszierten, konnte über die Auswertung der Fluoreszenzintensität der Zellen eine Zunahme oder Abnahme der intrazellulären Toxoplasmen oder Nanopartikel verfolgt werden. Zur Kontrolle, ob die mit der Durchflusszytometrie erhaltenen Daten auch mit dem wirklichen Geschehen in den Proben übereinstimmten, wurde zusätzlich auch die Mikroskopie eingesetzt. Mit dem etablierten Modell konnten reproduzierbare Ergebnisse gewonnen werden. Der Vergleich zwischen den mit Arzneistoff beladenen Nanopartikeln ergab, dass Spiramycin effektiver war als Pentamidin. Die Therapieerfolge der Partikel ohne Arzneistoff wurde mit einer Stimulation der Makrophagen durch die aufgenommenen Nanopartikel begründet. Die Toxoplasmen bewirkten nach dem Eindringen in die Zellen eine Hemmung der Makrophagen-Aktivität, die aber durch Zugabe von Nanopartikeln offensichtlich wieder aufgehoben wurde. Ein Versuch, der darlegen sollte, ob die Nanopartikel auch zur Prophylaxe (Gabe vor der Infektion) eingesetzt werden könnten, zeigte, dass dieses nicht der Fall ist. Die Infektion konnte nicht verhindert werden. Des Weiteren konnte kein Unterschied in der Partikelphagozytose durch infizierte oder nicht- infizierte Zellen gefunden werden. Während die größeren MC80cs-Partikel insgesamt stärker von den Zellen aufgenommen wurden als die kleinen MC81cs- Partikel, zeigten die kleineren die besseren toxoplasmiziden Effekte. Demnach wurde die stimulierende Wirkung, die die Nanopartikel auf die Zellen ausübten durch eine zu große Partikelaufnahme vermindert. Mit dem vorgestellten Modell können Effekte von Nanopartikeln auf intrazelluläre Parasiten gemessen werden und vielfältige Untersuchungen der Wirkung und Wechselwirkung von Nanopartikeln auf infizierte Zellkulturen untersucht werden. Damit ist das System in der Lage einen Beitrag zur Charakterisierung/Optimierung therapeutisch interessanter Nanopartikel im Hinblick auf z.B. \- Größe \- Ladung (Zetapotential) \- und Beladung (z.B. mit Arzneistoff) zu leisten sowie als Ersatz zum Tiermodell zu dienen.

The purpose of this thesis was to develop a system in which the effect and interaction of nanoparticles in infected cellcultures could be measured. Mice macrophage cell line J774-A1 and GFP-transfected Toxoplasma gondii were used as a model system. In addition the particles were loaded with drugs to analyze whether the therapy of toxoplasmosis could be improved with drug-carrier- systems. With the use of macrophages which are capable of absorbing drug- loaded particles via phagocytosis it was anticipated that this would lead to an intracellular accumulation of the drug. A few important physiochemical parameters of nanoparticles were analyzed for a more detailed characterization. The particles used consisted of a non biodegradable polystyrene-core and a polybutylcyanoacrylate-shell which contained the drug (Spiramycin or pentamidine). The measurement of the particle size was done by photon correlation spectroscopy (PCS). The particle charge which was measured as zetapotential (ZP) has also an impact on the uptake of nanoparticles by the cells of the RES. Another parameter which was important for the uptake of particles is surface hydrophobicity. Hydrophobic nanoparticles are phagocytized in favour of hydrophilic ones. Hydrophobic particles interact with blood components over hydrophobic interdependencies which lead to a higher particle uptake by the macrophages. The loading of drugs had no significant impact on parameters investigated. The enzymatic degradation of PBCA showed that the particles were degraded at least altered in a way that incorporated drug was released - within 200 minutes. This assured that the particles were degraded and the drug was set free within the 3 days of testing. A prerequisite for the use of nanoparticles as drug-carrier-systems is a high rate of loading with drugs. With that the necessary particle dosis for an application can be reduced. The relative rate of load of the particles was determined by the amount of drugs remaining in dispersion medium. It was shown that the rate of loading of the particles was higher than 95 percent. In the context of this thesis an in-vitro model was developed which made it possible to monitor and evaluate the infections of macrophages with Toxoplasma gondii and the treatment with nanoparticles. An infected cell-culture system, in which the effect of nanoparticles with or without drugs was measured over a period of three days (that is equivalent to several cycles of parasite multiplication) is similar to an animal-model and represents a valuable addition to test-systems Uptake and fate of nanoparticles and parasites was measured with a fluorescence activated cell sorter (FACS). That made it possible to determine the number of macrophages and the percentage of infected or with nanoparticles loaded cells as well as the extracellular parasites. Measuring the green fluorescence of the T. gondii and the red fluorescence of nanoparticles the intensity of fluorescence of infected or particle loaded cell corresponds with the concentration of intracellular Toxoplasma gondii and nanoparticles respectively. Initially all experiments with FACS should be controlled by microscopy, to prove that the interpretation of the FACS-data is consistent with the images seen under the microscope. With the established model repeatable results could be attained. During the experiments with the nanoparticles loaded with drugs it was shown that pentamidine had no influence on the system in opposite, there was a better effect of particles without this substance. The efficiency of the particles without drugs is explained by stimulation of macrophages by internalised. Toxoplasma gondii caused an inhibition of macrophages-activity after cell intrusion which could be neutralised by addition of nanoparticles. An experiment which had to reveal whether nanoparticles could be used as a prophylaxis before a toxoplasmosis showed that this was not the case because the effect of particles on infected cells was the same as on prophylaxis. Prophylaxis and treatment of infected cells resulted both in a reduction of parasite multiplication. On the other side, infection did not alter the uptake of nanoparticles - infected and non- infected cells internalised the same amount of nanoparticles. While the bigger MC80cs-particles were more internalised from the cells the smaller MC81cs- particles showed a better toxoplasmicide effect. According to this a stimulatory effect of nanoparticles on the cells was diminished/reduced by an uptake of to many particles. With the presented model effect of nanoparticles on intracellular parasites could be measured and numerous investigations of effects and interactions of nanoparticles on infected cellcultures could be done. With that the system is capable to contribute to the characterisation/optimization of therapeutical interesting nanoparticles with regard to size charge and load (e.g. with drugs) as well as an alternative to animal-models.