Virologische und Molekularbiologische Studien zur Verbreitung und Bedeutung von EHV-5-Infektionen beim Pferd

Abstract

Die hier vorliegende Dissertation widmet sich der Bedeutung und Verbreitung des Equinen Herpes Virus Typ 5. Im Vordergrund stand die Frage, ob EHV-5 in Deutschland vorkommt, in welchen Probenmaterialien man das Virus nachweisen kann und ob es an respiratorischen, ophthalmologischen und unspezifischen Symptomen beteiligt ist. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob Doppelinfektionen des EHV-5 mit dem EHV-1, dem EHV-2 und dem EHV-4 vorkommen und ob ein Einfluss von Impfstoff und Immunmodulator auf die Präsenz des EHV-5 vorhanden ist. Zuletzt wurden Untersuchungen zum Gewebe- und Zelltropismus des EHV-5 mittels nPCR und in-situ-Hybridisierung vorgenommen. Zur Untersuchung standen zwei Gruppen zur Verfügung. Zum einen die Gruppe der gesunden Pferde, welche aus 18 Pferden bestand und zum anderen die Gruppe der kranken Pferde, welche sich aus 107 Pferden zusammensetzte. Insgesamt wurden 125 Pferde untersucht. Für die Untersuchungen zum Gewebe- und Zelltropismus wurden post- mortem Konjunktivalgewebeparaffinschnitte von sechs verschiedenen Pferden und PBMC von 5 verschiedenen Pferden herangezogen. EHV-5 konnte bei 34 von insgesamt 125 Pferden detektiert werden. Dabei ließ sich EHV-5 bei 6/18 klinisch gesunden Pferden in PBMC und bei 28/107 klinisch kranken Pferden, davon bei 25/82 augenkranken und bei 3/19 Tieren mit unspezifischen Symptomen nachweisen. Bei den 25 EHV-5 positiven, augenkranken Tieren wurde EHV-5 in 18 Cytobrushproben(18/90), in zwei Wattetupfern (2/11), in sechs PBMC (6/72) und in zwei Nasentupfern (2/6) detektiert. Dass die Anzahl der EHV-5 positiven, augenkranken Pferde nicht mit der Anzahl der EHV-5 positiven Proben übereinstimmt, kann dadurch erklärt werden, dass von einem Pferd zum Teil mehrere Proben (Augen-, Nasentupfer und PBMC) gleichzeitig eingesandt und untersucht wurden. Bei den drei EHV-5 positiven Pferden mit unspezifischen Symptomen wurde EHV-5 in zwei Cytobrushproben (2/90) und einmal in PBMC (1/72) nachgewiesen. EHV-2 und EHV-5 Doppelinfektionen konnten bei drei augenkranken Pferden (3/82) in drei Cytobrushproben (3/90) und bei zwei klinisch gesunden Pferden (2/18) in zwei PBMC (2/72) nachgewiesen werden. Das EHV-2 Genom konnte bei 7 klinisch kranken (7/107) davon bei 5 augenkranken Pferden (5/82), in drei Cytobrushproben (3/90) und in vier Wattetupfern (4/11) und bei zwei gesunden Pferden (2/18) in zwei PBMC (2/72) detektiert werden. Weiterhin konnte diese Arbeit keine Hinweise auf Doppelinfektionen des EHV-5 mit dem EHV-1 und dem EHV-4 liefern. Nach der einmaligen Behandlung von 18 Pferden aus der Gruppe der klinisch gesunden Probanden mit Resequin NN Plus® und der dreimaligen Applikation des Immunmodulators Zylexis® wurde festgestellt, dass in vor der Behandlung EHV-5-positiven PBMC nach der Behandlung kein Virusgenom mehr detektiert werden konnte. EHV-5 konnte in frischem Konjunktivalgewebe von einem von sechs gesunden Schlachtpferden per nPCR detektiert werden. Paraffinschnitte von post-mortem Konjunktivalgewebe von allen sechs Pferden wurden per in-situ-Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten-EHV-5 -Genom-Sonde auf das Virus-Genom untersucht. EHV-5 wurde in der Lamina propria der Konjunktiva palpebralis in post-mortem-Paraffinschnitten von einem Pferd detektiert. Da alle Pferde per Anamnese klinisch gesund waren, könnte man vermuten, dass EHV-5 in Konjunktiven persistiert. PBMC von 5 klinisch kranken Pferden, welche alle im Vorfeld per nPCR EHV-5 negativ getestet wurden, zeigten in zwei von fünf Fällen nach in-situ-Hybridisierung mit der Digoxigenin-markierten-EHV-5-Genom-Sonde positive Signale. Dabei handelte es sich bei einem der zwei Pferde wahrscheinlich um unspezifische Hybridisierungsprodukte auf die EHV-5-Genom-Sonde in Granula ähnlichen Gebilden, die eventuell Kreuzreaktionen der EHV-5-Genom-Sonde mit homologen Sequenzen im zellulären Genom, wie etwa dem Virokin IL-10 mit zellulären IL-10 Sequenzen, darstellen könnten. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass mit den Resultaten dieser Arbeit Anzeichen für eine Beteiligung von EHV-5 an Augenerkrankungen beim Pferd gegeben werden konnten. Darüber hinaus könnten die Konjunktiven als Latenzort für EHV-5 vermutet werden.

The current dissertation is dedicated to the spreading and the relevance of the herpes virus type 5. The main question was whether EHV-5 is present in Germany, in which diagnostic materials and whether EHV-5 plays a decisive role in respiratory, ophthalmologic and unspecific symptoms. Furthermore, it was the objective to see, whether double infections with EHV-5 and EHV-1, EHV-2 or EHV-4 occur and whether vaccine and immune modulators have influence on the presence of EHV-5 At last the tissue- and cell tropism of EHV-5 was examined using nPCR and in-situ-hybridisation. There were two investigation groups: One group of clinically healthy horses, which consisted of 18 animals and a second group, which consisted of 107 sick horses. In total 125 horses were examined To study the tissue- and cell tropism nPCR and in-situ-hybridisation from post-mortem paraffin sections of conjunctival tissues from six different horses and PBMC from five different equines were conducted. EHV-5 was detected in 34 of 125 horses using nPCR. The virus was present in 6/18 clinically healthy horses in PBMC and in 28/107 clinically sick horses, especially in those with ophthalmologic symptoms (25/82) and in 3/19 horses with unspecific symptoms: EHV-5 was detected in 25/82 horses with ocular diseases in 18 cytobrushs (18/90), in two cotton wool swabs (2/11), in six PBMC (6/72) and in two nasal swabs (2/6). The number of the EHV-5 positive horses with ocular diseases does not match the number of the EHV-5 positive samples, because one or more samples (eye swabs, nasal swabs, PBMC) per horse were sent at a time and examined. EHV-5 was present in three horses with unspecific symptoms in two cytobrushs (2/90) and in one PBMC (1/72). Viral double infections of EHV-2 and EHV-5 were detected in three horses with ocular diseases (3/82) in three cytobrushs (3/90) and in two clinically healthy horses (2/18) in two PBMC (2/72). EHV-2 was detected in seven clinically diseased horses (7/107), thereof five ophthalmic equines (5/82), in three cytobrushs (3/90) and four cotton wool swabs (4/11), and in two clinically sound horses (2/18) in two PBMC (2/72). This work could not provide any new clues regarding the double infections with EHV-5 and EHV-1 or EHV-4. After a single treatment with Resequin NN Plus® and a triple application of the immune modulator Zylexis® none of the 18 clinically healthy horses, which were tested EHV-5 positive in PBMC before the therapy, were tested positive for the virus genome in PBMC. Fresh conjunctival tissues from six clinically healthy horses from the slaughterhouse were EHV-5-nPCR positive in one case. From all six cases post- mortem paraffin sections were tested for localization of the virus-DNA by in- situ-hybridisation using an EHV-5-Digoxigenin-labelled-genomic-probe. EHV-5-DNA was detected in cells of the lamina propria in sections of paraffin embedded conjunctiva of one horse. Since all horses were clinically healthy, one can conclude that EHV-5 persists in conjunctiva. PBMC from five clinically diseased horses were tested negative for EHV-5 using nPCR. Two of these five PBMC samples have shown positive signals after in-situ-hybridisation with the Digoxigenin-labelled-EHV-5-probe. Thereby, probably non specific hybridisation products on the EHV-5-genome-probe in granular structures were detected in one of the two horses. These signals could possibly be cross reactions of the EHV-5-genome-probe with homolog sequences in the cell genome, e.g. the Virokin IL-10 with cellular IL-10 sequences. In summary, it should be kept in mind that the results of this work have shown an indication for an involvement of EHV-5 on ophthalmologic diseases. Furthermore, conjunctival tissues could be assumed as a place of latency for EHV-5.