Antiinflammatorische Effekte des Na+/H+-Antiport-Inhibitors Cariporide

Abstract

Die Reperfusionstherapie ist bei einem Myokardinfarkt unvermeidbar, kann jedoch paradoxerweise auch zum Reperfusionsschaden führen. Durch Aktivierung des Na+/ H+-Austauschers während der Ischämie/Reperfusion kann es sekundär durch Aktivierung des Na+/Ca2+-Austauschers zur intrazellulären Kalziumanreicherung und eine dadurch ausgelöste Hyperkontraktur kommen. Zudem kann im Rahmen des subakuten Reperfusionsschadens die Adhäsionskaskade aktiviert und eine entsprechende Entzündungsreaktion induziert werden. Cariporide ist ein Na+/H+-Austausch-Inhibitor, der in präklinischen Studien sowohl den Ischämie/Reperfusionsschaden, als auch die damit einhergehende Entzündungsreaktion günstig beeinflusste. In unserer Studie überprüften wir folgende Fragestellungen: 1\. Beruht die Hemmung der Entzündungsreaktion durch Cariporide auf einer verminderten Expression der endothelialen Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und E-Selektin? 2\. Wirkt Cariporide dabei wie in Kardiomyozyten ebenfalls über eine Reduktion der zytosolischen Kalziumkonzentration? Zur Überprüfung der ersten Frage inkubierten wir HUVECS (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) mit Cariporide bzw. mit dem Lösungsmittel DMSO. Wir stimulierten die HUVECS mit TNF-alpha (zwischen 0 und 100 U/mL), und zwar 24 Stunden für den Nachweis von ICAM-1 und 5 Stunden für den Nachweis von E-Selektin. Nach Markierung mit einem fluoreszierenden Antikörper erfolgte die Messung am fluorescence activated cell sorter (FACS). TNF-alpha induzierte einen signifikanten Anstieg der Fluoreszenz für ICAM-1 und E-Selektin in der Kontrollgruppe (p=0,001). Nach Vorbehandlung der HUVECS mit Cariporide war die Expression beider Adhäsionsmoleküle vollständig supprimiert. Zur Überprüfung der zweiten Frage wurden HUVES mit dem Kalzium- sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 markiert. Ein Teil der Zellen wurde in kalziumfreiem Puffer, der andere Teil in kalziumhaltigem Puffer inkubiert. Zudem wurde jeweils die Hälfte der Zellen mit Cariporide bzw. DMSO inkubiert. Es erfolgte eine submaximale Stimulation mit TNF-alpha. Cariporide konnte die zytosolische Kalziumkonzentration im kalziumhaltigen Medium fast ebenso stark senken wie die Inkubation in kalziumfreiem Medium. TNF-alpha hatte keinen Einfluss auf die Kalziumkonzentration. Cariporide hemmt also die durch TNF- alpha induzierte Expression der pro-entzündlichen Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und E-Selektin. Wie erwartet spielt Kalzium keine Rolle als second messenger der Signalkaskade des TNF-alpha Rezeptors. Dennoch scheint eine Reduktion des intrazellulären Kalziumgehaltes auf subnormale Werte durch Cariporide an der Hemmung der TNF-alpha Wirkung beteiligt zu sein.

Reperfusion therapy, though inevitable in case of myocardial infarction, may worsen myocardial tissue damage by reperfusion injury. One putative mechanism involves activation of the NHX-exchanger during ischemia/reperfusion and secondary to that activation of the Na+/Ca2+-exchanger, which may induce cytosolic calcium overload and hypercontracture. Ischemia/Reperfusion can also activate the adhesion cascade and the subsequent inflammatory response. Cariporide is a NHX-exchanger inhibitor which reduced myocardial reperfusion injury and the inflammatory response in pre-clinical studies. In our study we aimed to answer the following questions: 1\. Is the anti-inflammatory action of cariporide mediated by reduced endothelial expression of the adhesion moleculesICAM-1 and E-Selectin? 2\. Is this effect of cariporide associated with a reduction ofthe cytosolic calcium concentration? To examine the first question, HUVECS (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) were incubated with eitherCariporide or the solvent DMSO. We stimulated HUVECS with TNF-alpha (up from 0 to 100 U/mL). Incubation timewas 24 hours to detect ICAM-1 and 5 hours to detect E-selectin expression. After staining with a fluorescent antibody, measurements were performed using a fluorescence activated cell sorter (FACS). TNF-alpha induced a significant rise of the fluorescence for ICAM-1 and E-selectine (p <0,001). After pre-treatment of the HUVECS with Cariporide this increase in adhesion molecule expression was completely suppressed. To examine the second question, HUVES were loaded with the calcium sensitive fluorescent dye Fluo-4. Cells had been cultured in calcium free or calcium-containing buffer. HUVECS were then incubated with Cariporide or DMSOand stimulated with a sub-maximal dose of TNF-alpha.Cariporide decreased the cytosolic calcium concentrationof cells cultured in calcium-containing medium nearly as much as culture in calcium-free medium. TNF-alpha had no influence on the cytosolic calcium concentration. Cariporide inhibits the expression of the pro- inflammatory adhesion molecules ICAM-1 and E-selectin induced by TNF-alpha. Although calcium is not directly involved as second messenger in the signal cascade of the TNF-alpha-receptor, the reduction of the cytosolic calcium concentration to sub-normal values by Cariporide may be involved in this effect.