Inhibition of chymotryptic-like standard proteasome activity exacerbates doxorubicin-induced cytotoxicity in primary cardiomyocytes

Abstract

Introduction The major limitation of doxorubicin, a potent anthracycline widely used for chemotherapy of different cancers including multiple myeloma, is its cardiotoxicity. This study shows the crucial role of the ubiquitin- proteasome system, the major cellular protein degradation pathway composed of the ubiquitin-conjugating system and the multicatalytic protease complex, and its involvement in antagonizing doxorubicin-induced cytotoxicity. Since the combination of doxorubicin with proteasome inhibitors is a common therapeutic strategy for multiple myeloma, the influence of proteasome subunit-specific inhibitors on doxorubicin cytotoxicity was further examined. Methods A representative cell culture model with primary murine embryonic cardiomyocytes was established to study doxorubicin-induced cytotoxicity and proteasome function. More specifically, subunit-selective inhibitors of β5, one of the three catalytic subunits of the constitutive standard proteasome, and LMP7, its equivalent of the inducible immunoproteasome preferentially expressed in cells of hematopoietic origin, were used to investigate the influence of proteasome inhibitors on doxorubicin cytotoxicity. To examine the immunoproteasome’s influence on doxorubicin cytotoxicity in vivo, mice constitutively lacking LMP7 expression and their wild-type littermates were subjected to a single intraperitoneal doxorubicin injection followed by cardiac evaluation using echocardiography, creatine kinase and troponin T levels, as well as histologic assessment. Results Doxorubicin had time- and dose-dependent cytotoxic effects on primary murine cardiomyocytes. The proteolytic capacity of the proteasome, evaluated by hydrolysis of both short fluorogenic peptide substrates and surrogate full-length protein substrates as well as by accessibility of catalytically active sites visualized with fluorescent activity-based probes, remained unaltered during initiation of doxorubicin-induced cytotoxicity. Furthermore, expression levels of proteasome subunits and proteins marked for proteasomal degradation by poly- ubiquitination stayed steady. Site-specific inhibition of the β5 standard proteasome subunit resulted in significantly increased doxorubicin cytotoxicity. In contrast, inhibition of LMP7 in primary cardiomyocytes did not enhance doxorubicin cytotoxicity, nor did LMP7 expression affect acute doxorubicin cardiotoxicity in adult murine hearts. Discussion The preserved proteolytic capacity of the proteasome complex attenuates early doxorubicin- induced cytotoxicity. Particularly the activity of the β5 standard proteasome subunit is crucial for reducing off-target cytotoxicity in doxorubicin-exposed primary cardiomyocytes, whereas the β5 equivalent LMP7 of the immunoproteasome can be regarded as a pharmacologically safe target for therapeutic subunit- specific inhibitors. Therefore, immunoproteasome-specific inhibitors with known antineoplastic effects for multiple myeloma cells might be favorable for reducing off-target cardiomyocyte death in a combinatory therapy with doxorubicin, when compared to compounds that target the β5 subunit in addition to LMP7.

Einführung Das Anthrazyklin Doxorubicin ist als Zytostatikum wichtiger Bestandteil der Therapie zahlreicher Krebserkrankungen, auch der des multiplen Myeloms. Eine folgenschwere Nebenwirkung ist die dosis-abhängige Kardiotoxizität, welche unter anderem durch Verlust von Kardiomyozyten zu Herzinsuffizienz führen kann. Diese Studie zeigt, dass das Ubiquitin-Proteasom System – der wichtigste zelluläre Proteinabbaumechanismus bestehend aus Ubiquitin-konjugierendem System und einer multikatalytischen Protease – entscheidend dazu beiträgt, der Doxorubicin-induzierten Zytotoxizität entgegenzuwirken. Da eine der Behandlungsstrategien bei Patienten mit multiplem Myelom eine Kombination aus Proteasominhibitoren und Doxorubicin ist, wurde untersucht wie sich neuartige Untereinheiten-spezifische Proteasom- Inhibitoren auf die Doxorubicin-Zytotoxizität auswirken. Methoden Ein repräsentatives Zellkulturmodell aus primären murinen embryonalen Kardiomyozyten wurde etabliert und mithilfe dessen die Doxorubicin-induzierte Zytotoxizität untersucht sowie die Proteasomaktivität beurteilt. Um zu untersuchen, wie Proteasomhemmung die Entwicklung der Doxorubicin- Zytotoxizität beeinflusst, kamen spezifische Proteasominhibitoren zum Einsatz, die durch kovalente Bindung einerseits an die β5‑Untereinheit des ubiquitär exprimierten Standardproteasoms und andererseits an die LMP7-Untereinheit des Immunoproteasoms eine kompetitive irreversible Hemmung bewirken. Ferner wurde die Rolle des Immunoproteasoms bei der Doxorubicin-Zytotoxizität im Mausmodell mit LMP7-defizienten Mäusen im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern weiter charakterisiert. Dabei wurde nach einer einmaligen intraperitonealen Doxorubicin-Injektion die kardiale Funktion durch Surrogat-Parameter echokardiographisch, über Kreatinkinaseaktivitäts- und Troponin T‑Konzentrationsmessungen pathobiochemisch sowie histologisch beurteilt. Ergebnisse In primären murinen embryonalen Kardiomyozyten wirkte Doxorubicin zeit- und dosisabhängig zytotoxisch. In der frühen Phase des Doxorubicin- induzierten Zelluntergangs blieb die proteolytische Aktivität des Proteasoms, welche durch Messung der Substrathydrolyse und Nachweis der katalytischen Zentren mittels fluoreszierenden Activity-based probes beurteilt wurde, erhalten. Des Weiteren zeigte sich eine gleichbleibende Proteinexpression der Proteasomuntereinheiten und der für proteasomalen Abbau markierten poly- ubiquitinierten Proteine. Die spezifische Inhibition der β5‑Untereinheit des Standardproteasoms bewirkte eine verstärkte Doxorubicin-Zytotoxizität. Im Gegensatz dazu führte weder die LMP7-Hemmung in primären Kardiomyozyten noch die genetische Ablation von LMP7 im adulten murinen Herzgewebe zu einer Zunahme der Doxorubicin-Zytotoxizität. Diskussion Die in der frühen Phase des Doxorubicin-induzierten Zelluntergangs erhaltene proteolytische Aktivität des Proteasomkomplexes wirkt der Zytotoxizität von Doxorubicin entgegen. Speziell die Aktivität der β5‑Untereinheit ist bei der Gegenregulation der Doxorubicin- induzierten Kardiotoxizität in primären Kardiomyozyten von entscheidender Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz dazu das β5‑Äquivalent des Immunoproteasoms LMP7 als pharmakologisch geeignetes Zielmolekül einer therapeutischen Proteasominhibition angesehen werden kann, da unerwünschte Nebenwirkungen reduziert würden. Daher wären zur Reduktion der Kardiotoxizität bei Kombinationstherapie des multiplen Myeloms mit Proteasominhibitoren und Doxorubicin solche Wirkstoffe zu bevorzugen, die ausschließlich LMP7 des Immunoproteasoms inhibieren und nicht zusätzlich die β5‑Untereinheit des Standardproteasoms hemmen.