Das Expressionsmuster von Plasticity Related Gene 3 und Plasticity Related Gene 4 im sich entwickelnden Gehirn der Ratte

Abstract

Phospholipide sind bioaktive Signalmoleküle, die aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens ein breites Wirkungsspektrum aufweisen. Durch ihren rezeptorvermittelten Einfluss auf zahlreiche zelluläre Aktivitäten, wie z.B. die Zellmigration, Zellproliferation, Zellaggregation oder Änderung des Zytoskeletts, sind Phospholipide unter anderem in Prozesse der Angiogenese und Atherosklerose, Wundheilung und Entzündungsreaktion oder Tumorentstehung bzw. des Tumorwachstums involviert. Darüber hinaus werden den bioaktiven Phospholipiden regulatorische Funktionen unter anderem in Entwicklungsprozesse im ZNS zugesprochen. In den letzten Jahren wuchs in diesem Zusammenhang auch das wissenschaftliche Interesse an Phospholipid-modulierenden Proteinen im ZNS, die Phospholipid-vermittelte Prozesse unter anderem durch die Modifikation des Verhältnisses zwischen den Phospholipiden und ihren zum Teil ebenfalls bioaktiven Metaboliten regulieren. Solch ein Phospholipid- modulierendes Protein, das Plasticity Related Gene (PRG-1), wurde auf der Suche nach Proteinen, die in Regenerationsprozesse im ZNS involviert sind, entdeckt. Zu der Gruppe der PRGs zählen mittlerweile fünf Mitglieder, die alle gehirnspezifisch exprimiert werden. Ergebnisse zum PRG-3-Protein auf zellulärer Ebene in der Spezies Maus bzw. zur PRG-3-mRNA in den Spezies Maus und Ratte zeigten eine dynamische Expression während der Gehirnentwicklung. Weiterhin induziert eine Überexpression des rekombinanten PRG-3-Proteins eine Veränderung der Zellmorphologie in vitro. Zu PRG-4 existieren bisher keine veröffentlichten Ergebnisse. In dieser Arbeit wurde nun anlehnend an publizierte Daten das Expressionsmuster von PRG-3 und PRG-4 systematisch im sich entwickelnden Rattengehirn auf Proteinebene in vivo untersucht. Mit Hilfe eines nicht kommerziell erhältlichen polyklonalen Antikörpers wurde eine zeitabhängige Expression des PRG-3-Proteins während Gehirnentwicklung bestätigt. Während der spätembryonalen und frühpostnatalen Entwicklung im Kortex wurde stützend auf publizierte Ergebnisse über eine Verschiebung des mRNA-Signals von basalen Schichten in apikalere Schichten ebenfalls beobachtet, dass das PRG-3-Protein spätembryonal in höheren Schichten der kortikalen Platte lokalisiert ist. In der Immunhistochemie fiel zusätzlich auf, dass das PRG-3-Protein in den zunehmenden postnatalen Entwicklungsstadien stetig schwächer in den distaleren Abschnitten von Dendriten detektierbar war. Diese Ergebnisse lassen auf einen Einfluss des PRG-3-Proteins in Prozesse der Zellmigration und damit der Kortikogenese und der Dendritogenese schließen. Ferner wurden in dieser Arbeit bereits vorliegende Untersuchungsergebnisse zur mRNA- und Proteinexpression auf zellulärer Ebene bekräftigt, die ergaben, dass PRG-3 neuronenspezifisch exprimiert wird. In Doppelimmunfluoreszenzanalysen in Rattengehirnen wurde keine Expression des PRG-3-Proteins in Gliazellen nachgewiesen. Des Weiteren ergab eine Subspezifizierung der Neurone mittels Interneuronmarkern, dass PRG-3 in Projektions- und Interneuronen exprimiert wird. Feinmorphologisch fiel ein stark gepunktetes Färbemuster von PRG-3 auf, das vornehmlich dendritisch lokalisiert war. Bei Doppelimmunfluoreszenzanalysen mit präsynaptischen Markern wurde zu einem geringen Anteil eine Kolokalisation in exzitatorischen und inhibitorischen Synapsen detektiert. Ultrastrukturell bestätigte sich eine Lokalisation von PRG-3 in Membranstrukturen. Demnach könnte PRG-3 als Membranprotein und als ein Mitglied einer Gruppe von Proteinen, die Phospholipidsignale modulieren, dort in Signalwege involviert sein. Die Expression des PRG-4-Proteins wurde ebenfalls systematisch mit einem nicht kommerziell erhältlichen polyklonalen Antikörper in vivo im Rattengehirn analysiert. Im Gegensatz zu PRG-3 wurde das PRG-4-Protein während der Gehirnentwicklung konstant exprimiert. Darüber hinaus wies PRG-4 erst ab dem Tag der Geburt eine starke Expression auf. Während der postnatalen Entwicklung des Cerebellums wurde PRG-4 zunächst überwiegend in Vorläuferzellen der äußeren Körnerzellschicht, aus der postnatal junge Körnerzellen in die definitive Körnerzellschicht migrieren, detektiert. Deshalb wurde postuliert, dass PRG-4 an der Neurogenese der Körnerzellen im Cerebellum beteiligt ist. PRG-4 wurde stark in Neuronen und in Oligodendrozyten verschiedener Reifestadien detektiert. Ultrastrukturell war PRG-4 ebenfalls in Membranstrukturen lokalisiert. Nach seiner Präsenz in verschiedenen Reifestadien von Oligodendrozyten könnte PRG-4 eine Rolle bei der Myelinisierung zugesprochen werden. Das PRG-4-Protein wurde im Unterschied zum PRG-3-Protein nicht in präsynaptischen Strukturen lokalisiert. Es wies eine ausschließliche Expression in Dendriten auf. Damit kann davon ausgegangen werden, dass PRG-4 postsynaptisch lokalisiert ist. Die in dieser Arbeit erhobenen Ergebnisse zeigten ein eher komplementäres Expressionsmuster zweier phylogenetisch naher verwandter Membranproteine, für die modulierende Einflüsse auf Phospholipide postuliert werden. Die systematische Analyse der Expression während der Gehirnentwicklung am Beispiel der Spezies Ratte sollte ein weiterer Baustein zur Erforschung des Zusammenspiels zwischen Phospholipiden und den PRGs und daraus resultierender molekularer Mechanismen von Entwicklungsprozessen des ZNS sein.

Phospholipids are bioactive signaling molecules which provide a large range of effects due to their ubiquitous occurrence. They influence receptor-mediated numerous cellular processes, e.g. cell migration, cell proliferation, cell aggregation and changes in the cell morphology. Thus, phospholipids are involved in angiogenesis, atherosclerosis, wound healing, inflammation reaction, tumor development and tumor progression. Moreover, these molecules and their modifying proteins are implicated to be involved in processes of CNS development by modulating the extracellular and intracellular levels of these phospholipids. One of this phospholipid modifying proteins, Plasticity Related Gene (PRG-1), was identified in a screening assay after neural trauma and is involved in processes of regeneration of the CNS. Up to date five members of the Plasticity Related Gene family were identified. They show a vertebrate- specific and exclusively neuronal expression. First results for PRG-3 revealed a dynamic expression pattern during mouse brain development. Furthermore, overexpression of PRG-3 induces changes in cell morphology. This study investigated systematically the expression pattern of PRG-3 und PRG-4 during rat brain development. By means of not commercially available antibodies the dynamic expression pattern of PRG-3 during rat brain development could be proved. In late embryonal development the PRG-3 signal switched from basal to more apical layers in the developing cortex as shown on mRNA level previously. During further postnatal development the intensity of the PRG-3 signal in the dendrites decreased continuously. These results implicate a role for PRG-3 in cell migration and thus corticogenesis and dendritic genesis. In immunofluorescence double stainings the neuron specific expression of PRG-3 could be confirmed. According to investigations using electron microscopy a localization of PRG-3 in the cell membrane could be demonstrated. The expression pattern of PRG-4 was systematically analyzed in vivo during rat brain development, respectively. In contrast to PRG-3 this Protein was constantly expressed, whereat PRG-4 was the first time detectable at birth. PRG-4 exhibited a dominant expression in dendrites and could not be co- localized by presynaptic markers, whereas PRG-3 was predominantly located in the proximal parts of dendrites and could weakly be found in presynaptic side. A strong expression of PRG-4 was found in young neurons in the outer granular cell layer of the cerebellum, a region young neurons migrate into the definite granular cell layer. These results implicated a role for PRG-4 in neurogenesis in the cerebellum. An expression of PRG-4 in all developmental stages of oligodendrocytes presumed an influence for PRG-4 in myelination. In conclusion PRG-3 and PRG-4 show a complementary expression pattern during rat brain development. The precise analysis of two members of the plasticity related gene family in the rat brain in vivo might help to understand the interaction between phospholipids and Plasticity Related Genes during development processes in the CNS.