Aryl Hydrocarbon Receptor: Molecular Mechanisms and Structural Determinants of Activation and Physiology

Abstract

The aryl hydrocarbon receptor (AHR) is a ubiquitous ligand-dependent transcription factor from the bHLH-PAS-protein family. Discovered as the central toxicity mediator of xenobiotic substances like TCDD and several PAKs, the AHR gained recently further attention due to identification of various endogenous ligands and associated physiological functions. Despite longtime investigation especially of the murine AHR, some important questions about molecular receptor interactions are still open. The newly discussed possibilities for pharmacological intervention in pathological and physiological AHRdependent processes additionally increase the interest in the detailed study of the human AHR. In this thesis, different aspects of molecular physiology of the human AHR were addressed in detail. In the first presented publication, alongside the kinetics of ligand-dependent AHR nuclear import, the mechanism of nucleocytoplasmic shuttling was examined. Using a fluorescent AHR fusion construct and a newly developed live-cell imaging method, it was demonstrated that the ligandindependent endogenous nuclear import and export are occurring permanently and rapidly, while ligands accelerate the import process effectively. Further, indepth mutagenesis studies have clearly shown that the nuclear localization signal acts autonomously and constitutively, while the export of the AHR is strictly dependent not only on the nuclear export signal, but also on an amino acid within the glutamine-rich domain of the protein (valine 647). Further, the adjacent region spanning residues 650 to 661 seems to be strictly required for ligand-induced nuclear accumulation of the AHR. The second part of this work focused on the ligand binding of the human AHR. Both the gene induction and the previous step of ligand-induced nuclear import were assessed semi- quantitatively as endpoints for receptor activation. The endogenous ligands triggered a rapid and transient induction of the AHR, suggesting a specific mechanism of activation. In contrast, the analyzed xenobiotic ligand triggered a delayed, but persistent activation of the AHR, implying an unspecific mode of action. Using site-directed mutagenesis histidine 291 (H291) within the ligand binding domain (LBD) was identified as essential for ligand-dependent activation of the human AHR, but not for the nucleocytoplasmic shuttling. This indicates that the basal import in context of shuttling does not depend on low level exposure against endogenous ligands. In contrast to the homologous murine mutant, the Q383A mutant did not show any impairment in the ligand response, providing additional evidence for the species specificity of the AHR. With computational methods a mechanistic explanation for the involvement of H291 in the mediation of ligand activity of human AHR was developed for the first time. On the one hand, it is conclusive that H291 plays a major role in the shaping of the ligand binding site including mediation of direct interactions with ligands. On the other hand, this residue might be crucial for the formation of ligand-induced AHR-ARNT heterodimer and consequently for further activation steps. Taken together, this thesis offers a new perspective on the significance of nucleocytoplasmic shuttling and export regulation of the human AHR. In addition, detailed and novel insights into the molecular mechanisms of receptor activation and the role of individual amino acids within the human AHR LBD are summarized. The data are also a valid basis for further applied research.

Der Arylhydrocarbon Rezeptor (AHR) ist ein ubiquitärer ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor aus der Familie der bHLH-PAS-Proteine. Entdeckt als der zentrale Vermittler der Toxizität von xenobiotischen Substanzen wie TCDD und diversen PAKs, erlangte der AHR in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit durch die Identifizierung seiner endogenen Liganden und damit zusammenhängenden physiologischen Funktionen. Trotz langjähriger Erforschung vor allem des murinen Rezeptors, sind noch wichtige Fragen bezüglich der molekularen Interaktionen offen. Die aktuell diskutierten Möglichkeiten zur pharmakologischen Intervention in pathologische und physiologische AHR- abhängige Prozesse steigern zusätzlich das Interesse an der ausführlichen Untersuchung des humanen AHR. In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der molekularen Physiologie des humanen AHR im Detail analysiert. In der ersten vorgestellten Publikation wurden neben der Kinetik des ligandenabhängigen AHR- Kernimports auch die Mechanismen des nukleozytoplasmatischen Shuttlings untersucht. Mit einem fluoreszierenden AHR-Fusionskonstrukt und einer neu entwickelten Live-Cell- Imaging-Methode wurde gezeigt, dass der ligandenunabhängige endogene Kernimport und Rückexport permanent und hochdynamisch ablaufen, wobei die Liganden den Importprozess effektiv beschleunigen. Weiterhin haben eingehende Mutationsstudien verdeutlicht, dass das Kernlokalisationssignal autonom und konstitutiv aktiv ist, während der Export des AHR nicht nur vom Kernexportsignal, sondern auch von einer Aminosäure (Valin 647) innerhalb der glutaminreichen Domäne essentiell abhängig ist. Speziell für die ligandeninduzierte Anreicherung des Rezeptors im Zellkern scheint zusätzlich die angrenzende Proteinregion AA 650 - 661 verantwortlich zu sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit lag der Fokus auf der Ligandenbindung des humanen AHR. Dabei wurden als Endpunkte für die Aktivierung des Rezeptors sowohl die Geninduktion, als auch der vorhergehende ligandeninduzierte Kernimport semiquantitativ beurteilt. Es konnte gezeigt werden, dass endogene Liganden eine schnelle und zeitlich begrenzte Induktion des AHR bewirken, die auf eine spezifische Wirkung schließen lässt. Der untersuchte xenobiotische Ligand induzierte dagegen eine verzögerte aber dauerhafte Rezeptoraktivierung, was eine unspezifische Ligandenwirkung nahe legt. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde dann innerhalb der Ligandenbindungsdomäne (LBD) Histidin 291 (H291) als essentiell für die ligandenabhängige Aktivierung, aber nicht für das nukleozytoplasmatische Shuttling des humanen AHR identifiziert. Das zeigt, dass der basale Import nicht von einer Grundexposition gegenüber endogenen Liganden abhängig ist. Die Q383A Mutante wies im Gegensatz zur homologen murinen Mutante keine Beeinträchtigung in der Ligandenantwort auf, was einen zusätzlichen Hinweis auf die Speziesspezifität des AHR liefert. Mithilfe von computergestützten Methoden wurde dann erstmalig ein mechanistischer Erklärungsansatz für die Beteiligung des H291 an der Vermittlung der Ligandenwirkung im humanen AHR entwickelt. Einerseits ist es schlüssig, dass H291 eine wichtige Rolle in der Formung der Ligandenbindungstasche einschließlich der Vermittlung direkter Ligandeninteraktionen spielt. Andererseits könnte das Histidin entscheidend für die Entstehung des ligandeninduzierten AHR-ARNT-Heterodimers und damit auch für die weiteren Aktivierungsschritte sein. Insgesamt bietet diese Arbeit eine neue Sichtweise auf die Bedeutung des nukleozytoplasmatischen Shuttlings und der Exportregulation des humanen AHR. Zusätzlich werden neue und detaillierte Einblicke in die molekularen Mechanismen der Rezeptoraktivierung und in die Rolle von einzelnen Aminosäuren innerhalb der humanen AHR-LBD zusammengefasst. Die Ergebnisse bieten viele Ansatzpunkte für weiterführende angewandte Forschungsarbeiten.