Bedeutung genetischer Varianten von Toll-like-Rezeptoren (TLR) bei der schweren Malaria und Untersuchung zum TLR-Liganden Glykosylphosphatidylinositol (GPI)

Abstract

Genetische Wirtsfaktoren spielen eine entscheidende Rolle für die Anfälligkeit gegenüber der Malaria und für den Schweregrad der Erkrankung. Die Malaria tropica infolge der Infektion mit Plasmodium falciparum verursacht jährlich eine Millionen Todesfälle. Toll-Like-Rezeptoren (TLR) sind in vitro an der Erkennung von P. falciparum beteiligt; der Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker des Parasiten induziert über TLR-2 und TLR-4 den Signalweg in den Wirtszellen. Dabei induziert die Interaktion von mikrobiellen Liganden mit dem jeweiligen TLR die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen über die TLR/IL-2-Rezeptor-Domäne. Die TLR sind damit mutmaßlich zentrale Vermittler der Wirtsantwort im Sinne von Zytokinproduktion und Fieber bei der Malaria. Der parasitäre TLR-Ligand GPI induziert im Mausmodell die Symptome einer schweren Malaria. Die Wirkung des P. falciparum-GPI auf humane Immunzellen ist dagegen unklar. Im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie bei 870 ghanaischen Kindern wurde die Bedeutung von TLR-2- und -4-Polymorphismen hinsichtlich der Anfälligkeit für die schwere Malaria untersucht. Zudem wurden in vitro Stimulationsassays mit murinen und humanen Zelllinien durchgeführt, um die Rolle von synthetischem P. falciparum-GPI bei der pro-inflammatorischen Antwort zu untersuchen. Bei Europäern und Asiaten häufige TLR-2-Polymorphismen konnten bei den ghanaischen Kindern nicht nachgewiesen werden. Allerdings wurde eine seltene, bisher nicht vorbeschriebene Mutation (Leu658Pro) detektiert, die die Signaltransduktion via TLR-2 beeinträchtigt. Der TLR-4-Polymorphismus Asp299Gly fand sich dagegen deutlich häufiger als bei Europäern. In der gesunden Kontrollgruppe wiesen 17.6% diese Variante auf; bei Patienten mit schwerer Malaria lag eine signifikante Häufung dieses Polymorphismus vor (24.1%, P < 0.05). In ähnlicher Weise wurde der Polymorphismus TLR-4-Thr399Ile bei 2.4% der gesunden Kontrollen und bei 6.2% der Patienten mit schwerer Malaria beobachtet (P = 0.02). Das Risiko (Odds), an schwerer Malaria zu erkranken, war bei Trägern der Polymorphismen TLR-4-Asp299Gly und TLR-4-Thr399Ile 1,5- bzw. 2,6-fach erhöht. Synthetisches P. falciparum-GPI induzierte allerdings keinerlei Zytokinproduktion in den untersuchten Zelllinien. Diese Ergebnisse verweisen erstmals auf die Bedeutung des TLR-Systems für die Manifestation der Malaria in vivo und somit auf die prinzipielle Möglichkeit, den Krankheitsverlauf dementsprechend zu beeinflussen. Insbesondere erhöhen in Afrika häufige TLR-4-Varianten das Risiko einer schweren Malaria. Die ausbleibende pro-inflammatorische Antwort bei Stimulation mit synthetischem P. falciparum-GPI spricht nicht zwingend gegen die Erkennung dieses Moleküls durch das TLR-System und eine Rolle bei der Pathophysiologie der Malaria, sondern ist wahrscheinlich auf strukturelle Abweichungen des synthetischen vom natürlich vorkommenden GPI zurückzuführen.

Genetic host factors play a critical role in susceptibility to malaria and its severity. Malaria tropica caused by Plasmodium falciparum results in over one million deaths annually. Toll-like-receptors have been shown in vitro to be involved in recognition of P. falciparum. The glycosylphosphatidylinositol anchor of P. falciparum induces signaling in host cells via TLR-2 und TLR-4. The interaction of the microbial ligand and the respective TLR results in the release of proinflammatory cytokines via the TLR/IL-2-receptor (TIR) domain. Thus, TLR may contribute as key host molecules to inflammatory responses including cytokine production and fever in malaria. In mice, P. falciparum GPI induces the symptoms of severe malaria while the effect of P. falciparum GPI on human immune cells remains unknown. In a case-control study among 870 Ghanaian children we examined the influence of TLR-2- and -4 polymorphisms in susceptibility to severe malaria. Additionally we examined the role of synthetic P. falciparum GPI in the proinflammatory immune response in in vitro stimulation assays using murine and human cell lines. TLR-2 polymorphisms frequently seen in Caucasians and Asians were completely absent in all Ghanaian children. However, we detected a rare and previously undescribed mutation (Leu658Pro) which impairs signaling via TLR-2 in vitro. On the contrary, the TLR-4 polymorphism Asp299Gly was observed at an extraordinarily higher rate than in Europeans. In healthy controls it was found in 17.6%; in severe malaria patients it occurred at a significantly higher frequency (24.1%, P < 0.05). The TLR-4 polymorphism Thr399Ile was found at similarly high rates, in 2.4% of healthy children and in 6.2% of patients with severe malaria (P = 0.02). The polymorphisms TLR-4 Asp299Gly and TLR-4 Thr399Ile conferred an 1.5- and 2.6-fold risk of severe malaria. Synthetic P. falciparum GPI did not induce cytokine production in the stimulated cells. These findings suggest an important role of TLR in malaria susceptibility in vivo and their potential influence on the progression of the disease. Especially in Africa common TLR-4 variants predispose to severe malaria. The absence of a proinflammatory immune response to stimulation with synthetic P. falciparum GPI observed here does not mean necessarily that TLR do not recognize P. falciparum GPI or that it does not play a role in the pathogenesis of malaria. This is more likely explained by structural differences between the synthetic P. falciparum GPI and natural GPI.