Generierung CMV-spezifischer Lymphozyten aus Stammzellapheresat

Abstract

In der Arbeit wurde die Möglichkeit der Generierung CMV-spezifischer Lymphozyten aus Stammzellapheresat für die adoptive Immuntherapie bei CMV- Erkrankung nach Stammzelltransplantation genauer untersucht. Zur Generierung der CMV-spezifischen Lymphozyten aus Stammzellapheresat wurde der INF-γ Sekretionsassay mit darauf folgender magnetischer Separation durchgeführt. Anschließend wurde ein Teil der Zellen durchflusszytometrisch untersucht und der andere Teil nach einer Kultivierungszeit mit Hilfe von MLR, Elispot und Zytotoxizitätsassay auf ihre Eigenschaften untersucht. Es zeigte sich, dass in eingefrorenem Stammzellapheresat CMV-spezifische T-Zellen besser zu detektieren sind als in kryokonserviertem Blut. Die Selektion CMV-spezifischer T-Zellen mit Hilfe des IFN-gamma Sekretionsassay gelang ebenso wie deren Kultivierung. Nach der 21-tägigen Kultivierung stellte sich bei der Untersuchung der Zellen mit Hilfe des Zytokinnachweises und des Elispots heraus, dass CMV-spezifische T-Zellen weiterhin vorhanden sind. Außerdem konnte mit dem Zytotoxizitätsassay gezeigt werden, dass diese Zellen in der Lage sind, CMV-infizierte Zelllinien zu lysieren. Durch die MLR stellte sich heraus, dass das Abwehrvermögen CMV-spezifischer T-Zellen nach 21-tägiger Kultur gegen körperfremde, nicht CMV-spezifische Zellen, verringert ist, was im Hinblick auf GvHD ein weiterer positiver Aspekt ist. Mit dem IFN-gamma Sekretionsassay im Großmaßstab wurden die bereits gewonnenen Erkenntnisse und Ergebnisse im klinischen Maßstab umgesetzt. Des Weiteren wurde versucht, mit dem Proliferationsassay einen weiteren Funktionalitätsassay zu etablieren.

This study is about the possibility of generation CMV-specific lymphocytes from stem cell apheresis for adoptive immune therapy for CMV-disease after stem cell transplantation. For generating of CMV-specific T-cells from stem cell apheresis we used the IFN-gamma secretion assay following the magnetic activated cell sorting (MACS). We analysed afterwards one part of the cells by flow cytometry and the other part after a cultivation time via MLR, ELISpot assay and cytotoxicity assay. It seems that in frozen stem cell apheresis CMV- specific T-cells are better detectable then in cryoconservated blood. The selection of CMV-specific T-cells via IFN-gamma secretion assay was also possible like there cultivation. After 21 day of cultivation we could demonstrate with the cytokin detection and the ELISpot, that we still have CMV-specific T-cells. With the cytotoxicity assay we could show, that these cells have the possibility to lyse CMV-infected cell lines. The MLR illustrate that the defence of CMV-specific T-cells after 21 days of cultivation against allogenic, non CMV-specific cells, is reduced.