CLCA Proteins in the Airways: New Insights into their Expression Patterns and Role in Innate Immunity in Pneumonia

Abstract

For more than 15 years, the CLCA (chloride channel regulator, calcium- activated) protein family has been in the focus of several research groups worldwide due to their strong implication in several important animal and human diseases. However, the functions of these molecules in normal tissues and their exact roles in diseases are still incompletely understood. Some CLCA proteins possess a well established role in inflammatory airway diseases with mucus overproduction, such as asthma, cystic fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease. In the respiratory tract, the human hCLCA1 and its mouse ortholog mCLCA3 are selectively expressed in mucus cells and have directly been linked to the trait of mucus cell metaplasia, a common feature of these diseases. In addition to mCLCA3, the murine mCLCA5 has also been associated with airway mucus cell metaplasia and a redundant or overlapping function of the two murine members was previously proposed. However, the cell types that express mCLCA5 in the airways were unknown. Consequently, in this study the cellular expression pattern of mCLCA5 was determined under healthy and challenged conditions in murine lungs. Since differences in expression patterns between different species have previously been observed for other CLCA proteins, the expression patterns of the mCLCA5 orthologous proteins in humans and pigs, hCLCA2 and pCLCA2, respectively, were also established to allow for a better understanding of animal models for human diseases. In healthy mice, mCLCA5 was found to be uniquely expressed in highly select regions of bronchial epithelial cells and in submucosal glands (SMG), consistent with the canonical anatomical locations of progenitor cell niches. Since club cells were the predominantly mCLCA5 expressing cell type, followed by fewer mucus cells and ciliated cells, it appears unlikely that mCLCA5 has a fully redundant function with mCLCA3 which is expressed in mucus cells only. Under conditions of challenge including instillation of phosphate buffered saline (PBS), Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) or influenza virus, mCLCA5 mRNA and protein expression strongly declined. Protein reappearance was observed only in models retaining intact epithelial cells (PBS, S. aureus). The unique localization of mCLCA5 to murine airway epithelial progenitor cell niches and the observation that mCLCA5 but not mCLCA3 is present in club cells as putative progenitors for mucus cells suggest that mCLCA5 but not mCLCA3 is the prime CLCA protein involved in mucus cell differentiation from precursor cells in mice. Of note, normal human and porcine bronchial epithelial cells did not express their respective mCLCA5 orthologs and SMG of both species had fewer expressing cells, indicative of fundamental differences in mice on the one side versus human and pigs on the other. In addition to their modulation of mucus production, the human hCLCA1 and possibly other CLCA proteins have also been implicated in vitro in the regulation of tissue inflammation in the innate immune response. Consequently, early immune responses were characterized in this study in vivo using a mouse model that lacks expression of mCLCA3, the mouse ortholog to hCLCA1. A S. aureus pneumonia model was employed in mClca3 knockout (mClca3-/-) mice and wild-type (WT) littermates. Experimental readouts included clinical symptoms, bacterial clearance, leukocyte immigration and cytokine responses in the bronchoalveolar compartment, pulmonary vascular permeability and histopathological changes. Furthermore, effects on mucus cell number and mucin gene expression levels as well as possibly compensatory differential regulation of other murine CLCA homologs were determined. Deficiency of mCLCA3 resulted in decreased neutrophilic immune cell infiltration into the bronchoalveolar space after S. aureus infection when compared to WT controls. Only the cytokines IL-17 and the murine CXCL-8 homolog CXCL-1, also termed KC, were decreased on mRNA and protein levels in infected mClca3-/- mice compared to WT controls. However, no differences were observed in clinical outcome, histopathology or mucus cell metaplasia. No evidence was found for regulation of other CLCA homologs that would putatively compensate for the lack of mCLCA3. In summary, this in vivo study clearly revealed that mCLCA3 plays a significant role in the early innate immune response in a S. aureus pneumonia mouse model via induction of select cytokines with subsequent immune cell recruitment. These data confirm and extend the functional understanding of previous in vitro observations on its human ortholog hCLCA1. Taken together, the results gained from this study substantially add to our knowledge on the expression patterns, functions in healthy and diseased airways as well as differences in expression between mice, humans and pigs for the two CLCA members most relevant for respiratory diseases. Still, other important challenges remain and several new questions were raised. Future studies should more closely define the putative role of mCLCA5 as modulator of progenitor cells in mucus cell differentiation and mucus cell metaplasia. Furthermore, the mechanisms, target cells and pathways of mCLCA3 modulating the inflammatory innate immune response will have to be established. Finally, we hope that this research on CLCA molecules and their roles in such devastating respiratory diseases will contribute to the development of more powerful therapeutic approaches in the future.

Seit mehr als 15 Jahren steht die CLCA (chloride channel regulators, calcium- activated) -Proteinfamilie aufgrund ihrer Bedeutung bei verschiedenen Erkrankungen von Mensch und Tier im Focus mehrerer Forschergruppen weltweit. Dennoch sind die Funktionen dieser Moleküle in gesundem Gewebe sowie deren genaue Rolle bei krankhaften Veränderungen bislang weitgehend unklar. Einzelne Proteine dieser Familie spielen insbesondere bei Atemwegserkrankungen mit sekretorischer Dysfunktion wie dem Asthma, der zystischen Fibrose oder der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung eine große Rolle. In der Lunge konnten hierbei vor allem das humane hCLCA1 und sein muriner Orthologer mCLCA3, welche ausschließlich in schleimproduzierenden Zellen exprimiert werden, mit der Entstehung von Mukuszellmetaplasien, als eine der Haupteigenschaften der genannten Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Neben mCLCA3 wurde jüngst ein weiterer CLCA-Vertreter der Maus, mCLCA5, ebenfalls mit der Entstehung einer Mukuszellmetaplasie in Verbindung gebracht und somit eine mögliche Kompensation und Redundanz beider Proteine vermutet. Jedoch waren die mCLCA5-exprimierenden Zelltypen bisher völlig unbekannt. Folglich wurde in dieser Studie das zelluläre Expressionsmuster von mCLCA5 in der gesunden und in der modellhaft erkrankten Mauslunge untersucht. Da unterschiedliche Expressionsmuster zwischen verschiedenen Spezies bereits für andere CLCA- Proteine beschrieben wurden, untersuchten wir auch die Expressionsmuster der mCLCA5-orthologen Proteine von Mensch und Schwein, hCLCA2 und pCLCA2, um eine bessere Beurteilung von Tiermodellen für humane Erkrankungen vornehmen zu können. Bei gesunden Mäusen konnte ein einzigartiges Expressionsmuster des mCLCA5-Proteins in hoch selektiven Bronchialepithelzellen sowie in den epithelialen Zellen der submukosalen Drüsen nachgewiesen werden. Diese anatomischen Lokalisationen entsprechen hierbei weitgehend dem Vorliegen von Progenitorzellnischen. Da mCLCA5 vorrangig in Club-Zellen und weniger in Mukus- und zilierten Zellen exprimiert wird und damit ein nur partiell überlappendes Expressionsmuster mit seinem Verwandten mCLCA3, der ausschließlich in Mukuszellen exprimiert wird, aufweist, erscheint ein vollwertiger Ersatz des einen Proteins durch das andere kaum möglich. Nach der Behandlung von Mäusen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder nach deren Infektion mit Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) oder Influenzaviren konnte eine deutliche Verminderung der mRNA- und Proteinexpression von mCLCA5 beobachtet werden. Die Proteinexpression erholte sich jedoch nach einiger Zeit ausschließlich in solchen Modellen mit intakt gebliebenem Epithel (PBS und S. aureus). Die einzigartige Expression des mCLCA5-Proteins in ausgewählten Atemwegsepithelien der Maus in anatomischen Nischen von Progenitorzellen sowie die Tatsache, dass mCLCA5 und nicht mCLCA3 in Club-Zellen als mögliche Vorläufer für Mukuszellen exprimiert wird, spricht vielmehr für mCLCA5 als dasjenige CLCA-Molekül, welches an der Differenzierung von Mukuszellen beteiligt ist. Interessanterweise wiesen das normale Bronchialepithel von Mensch und Schwein keine Expression der mCLCA5-Orthologen hCLCA2 und pCLCA2 auf, und auch die submukosalen Drüsen zeigten eine weitaus geringere Expression im Vergleich zur Maus. Dieses teils deutlich abweichende Expressionsmuster weist auf nicht zu vernachlässigende Unterschiede zwischen den einzelnen Spezies hin. Zusätzlich zu ihren vermuteten modulatorischen Funktionen in der Mukusproduktion wurden CLCA- Proteine, wie hCLCA1 und mögliche andere, bereits mit der Regulation von Entzündungen im Rahmen der angeborenen Immunität in vitro in Verbindung gebracht. Folglich wurde in dieser Studie eine frühe Immunantwort im in vivo Mausmodell charakterisiert. Dieses erfolgte in knockout-Mäusen, die das mCLCA3-Protein, also den Maus-Orthologen des humanen hCLCA1, nicht exprimieren. Hierbei wurde ein S. aureus-Pneumoniemodell in mClca3-/--Mäusen und Wildtyp (WT)-Kontrolltieren eingesetzt. Die Schwerpunkte der Untersuchungen lagen auf der zellulären und Zytokin-bedingten unspezifischen Immunantwort. Im Detail wurden der Verlauf der Lungenentzündung in Bezug auf klinische Symptome, die Beseitigung der bakteriellen Last, Leukozyteneinwanderung und Zytokinantwort im bronchoalveolären Raum, die vaskuläre Permeabilität der Lungengefäße sowie die histopathologischen Veränderungen der Lungen untersucht. Weiterhin wurden mögliche Effekte auf die Mukuszellzahl, die Muzingenexpression sowie auf die mögliche unterschiedliche Regulation der Expression anderer CLCA-Vertreter der Maus untersucht. Der Verlust des mCLCA3-Proteins in den mClca3-/--Tieren führte nach Infektion mit S. aureus im Vergleich zu WTKontrolltieren zu einer verminderten Einwanderung von neutrophilen Granulozyten in den bronchoalveolären Raum. Ausschließlich die Zytokine IL-17 sowie der murine CXCL-8-Homologe CXCL-1, auch KC genannt, waren deutlich in ihrer mRNA-Expression sowie in ihrem Proteingehalt in den infizierten mClca3-/--Mäusen, verglichen mit den WT-Kontrolltieren, erniedrigt. Es konnten keine Unterschiede im klinischen Verlauf, in der Histopathologie sowie in der Ausbildung einer Mukuszellmetaplasie festgestellt werden. Ferner fanden sich keine Hinweise für das Vorliegen einer Kompensation der mCLCA3-Defizienz durch andere CLCAHomologe im Sinne einer Regulation ihrer Genexpressionen. Zusammengefasst weisen die in vivo Ergebnisse deutlich darauf hin, dass das mCLCA3-Protein einen erheblichen Einfluss auf die frühe, unspezifische Immunantwort durch die Induktion ausgewählter Zytokine mit konsekutiver Immunzellrekrutierung nimmt. Diese Daten bestätigen und erweitern somit die funktionellen Aspekte, die bereits für den Orthologen hCLCA1 in vitro beobachtet worden waren. Insgesamt konnten hier substanzielle Ergänzungen zu den früher bekannten Expressionsmustern und möglichen Funktionen von CLCA-Proteinen bei gesunden und erkrankten Atemwegen sowie deutliche Unterschiede zwischen Mäusen, Menschen und Schweinen für die zwei wichtigsten CLCA-Mitglieder in der Lunge gewonnen werden. Dennoch bleiben wichtige Herausforderungen bestehen und die neuen Erkenntnisse werfen auch viele neue Fragen auf. Zukünftige Untersuchungen sollten nun zum einen die Rolle von mCLCA5 als möglicher Modulator von Progenitorzellen insbesondere bei ihrer Differenzierung zu Mukuszellen und die Entstehung einer Mukuszellmetaplasie beinhalten. Zum anderen sollten die Mechanismen und Zielzellen der immunmodulatorischen Funktionen von mCLCA3 im Rahmen der unspezifischen Immunität aufgedeckt werden. Schließlich besteht die Hoffnung, dass die Ergebnisse dieser Arbeit über zwei wichtige CLCA-Moleküle sowie deren Rolle bei verheerenden Atemwegserkrankungen von Tier und Mensch zu zukünftigen Entwicklungen effektiverer Therapieformen einen Beitrag leisten können.