Evaluierung neuer Verfahren zur lokalen Tumortherapie am VX2-Modell des Kaninchens

Abstract

Das kolorektale Karzinom wird in vielen Fällen erst in einem weit fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. Zu diesem Zeitpunkt ist es daher bereits häufig in die Leber metastasiert. In diesen Fällen müssen beim Patienten nicht nur der Ursprungstumor, sondern auch die Metastasen therapiert werden. Für die Behandlung der Lebermetastasen, aber auch primären Lebertumoren bieten sich lokale Verfahren an. Die Zielsetzung in diesem Projekt war die Untersuchung eines lokalen Therapieverfahrens zur Bekämpfung von Lebertumoren/-metastasen, welches entweder als neoadjuvante, adjuvante oder ausschließliche Behandlung angewendet werden kann. In der vorliegenden Studie sollte im Tierversuch eine möglichst schonende lokale Tumortherapie untersucht werden, die mit einer geringen Medikamenten-Dosis auskommt. Die Versuche zur Wirksamkeit und Verträglichkeit der Methode wurden an 20 Kaninchen mit in die Leber implantierten VX2-Tumoren durchgeführt. Der Grundgedanke war, durch die Beschichtung von Ballonkathetern eine lokale perkutane Behandlung mit therapeutisch wirksamen Substanzen zu ermöglichen. Durch die Zunahme der Oberfläche des Ballons bei der Expansion wird eine große Gewebefläche erreicht. Ferner wird durch den Druck des Ballonkatheters die Beschichtung nachhaltig in das Gewebe gepresst. Die Wirkstoffe sollten sich nur langsam auflösen bzw. aus dem Tumor abgeschwemmt werden. Die folgenden Zytostatika wurden ausgewählt: Paclitaxel, Arsentrioxid, 5-Fluorouracil, Fantolon, Bortezomib, Doxorubicin und Mitoxanthron. Außerdem wurde allen Wirkstoffen jeweils eine wirkstofffreie Kontrolle gegenübergestellt. Die sieben genannten Substanzen wurden bezüglich ihrer Zytotoxizität gegenüber VX2- Tumorzellen in vitro in Zellkultur überprüft. Dazu wurde jede einzelne Substanz in vier unterschiedlich hohen Konzentrationen (von 2 bis 32 μmol/l für Paclitaxel, Arsentrioxid, Fantolon, 5-Fluorouracil und Mitoxanthron; von 10 bis 25 μmol/l für Doxorubicin; von 0,1 bis 0,4 μmol/l für Bortezomib) jeweils für 24, 48 und 72 Stunden zu den VX2-Zellen gegeben. Als Kontrolle wurden Tumorzellen mit wirkstofffreier Lösung inkubiert. Die insgesamt verbleibende intramitochondriale Dehydrogenaseaktivität als Maß für die Vitalität der Tumorzellen im Vergleich zur Kontrolle war bei Verwendung des für jede Substanz niedrigsten ermittelbaren Mittelwertes bei Doxorubicin mit 12 3% (16 μmol/l nach 72 h) am geringsten und bei Arsentrioxid mit 52 4% (15 μmol/l bei 48 h) am höchsten von allen eingesetzten Wirkstoffen. Alle geprüften Substanzen waren wirksam und die Auswahl der Substanzen für die tierexperimentelle Studie erfolgte daher aufgrund der physikochemischen Eigenschaften, des Wirkmechanismus und der Erfahrung mit den Substanzen in früheren Untersuchungen für andere Indikationen. Limitierend auf die in vivo Versuche wirkte sich aus, dass nicht alle zuvor ausgewählten Testsubstanzen sich für das Auftragen auf die Ballonkatheter als geeignet erwiesen. Aus diesem Grund mussten für die Erprobung dieser Wirkstoffe im Tiermodell andere Applikationsformen gefunden werden. Arsentrioxid und Doxorubicin wurden mit einer Spritze direkt in den Tumor injiziert (je Gruppe vier Tiere). Pro Wirkstoff wurden vier Kaninchen behandelt. Die applizierte Dosis betrug bei Paclitaxel 1,57 bis 1,78 mg, bei Arsentrioxid 11,5 bis 22,0 mg, bei Fantolon 1,12 bis 1,16 mg und bei Doxorubicin 5,94 bis 20,78 mg. Im Studienverlauf wurden die Dosierungen für Arsentrioxid und Doxorubicin wegen guter Verträglichkeit und mangelnder Wirkung erhöht. Die Hälfte der Kontrollgruppe wurde mit einem unbeschichteten Ballonkatheter behandelt (zwei Tiere), bei der anderen Hälfte der Gruppe (zwei Tiere) eine Injektion mit physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt, um die mechanische Manipulation des Tumors bei der medikamentengestützten Behandlung zu imitieren. Die Wirksamkeit der Behandlung auf das Tumorwachstum wurde nach 1-2 Wochen mittels Computertomographie während und kurz nach Kontrastmittelinjektion kontrolliert. Im Computertomogramm ist der Tumor aufgrund einer gegenüber dem gesunden Lebergewebe geringeren Durchblutung als Perfusionsdefekt dargestellt. Eine Verminderung der Größe des Perfusionsdefekts nach der Therapie würde eine Abnahme der Tumorgröße anzeigen, während eine Zunahme der Größe des Perfusionsdefektes durch Tumorwachstum oder Nekrose bedingt sein kann. Deshalb wurde eine Anfärbung vitaler Gewebeanteile nach der Entnahme des Lebergewebes mit Perfusionsdefekt mittels TTC-Färbung durchgeführt. Die Wirkung der in vivo untersuchten Substanzen entsprach insgesamt nicht vollständig den Ergebnissen aus den im Vorfeld durchgeführten Zellversuchen. Nur bei zwei von insgesamt zwanzig Tieren wurde eine Verringerung des für den Tumor typischen Perfusionsdefektes in der Leber beobachtet: Ein Tier aus der mit Fantolon behandelten Gruppe (-36% gegenüber der Messung in der Vorwoche) sowie ein mit einem unbeschichteten Ballonkatheter behandeltes Kontrolltier (-6%). Bei den restlichen Tieren aus der Studie konnte nur anhand der unterschiedlichen Vergrößerung des Perfusionsdefektes eine Aussage über die Wirkung der eingesetzten Substanzen getroffen werden. Dabei schnitt die Gruppe der mit Paclitaxel behandelten Tiere mit der durchschnittlich geringsten prozentualen Größenzunahme (271 ± 186%) am besten ab, gefolgt von der Kontrollgruppe (903 ± 925%). Eine äußerst hohe Zunahme des Perfusionsdefektes in der Leber zeigte sich bei dem Therapieversuch mit Arsentrioxid (3.580 ± 4.871%), wobei der größte Teil des nicht oder minder-perfundierten Gewebes nekrotisch war. Keine der in dieser Studie erprobten Substanzen und Formulierungen hat in vivo die erwünschte überzeugende lokale zytotoxische Eigenschaft gezeigt. Dennoch ist nicht auszuschließen, dass Paclitaxel und Arsentrioxid nach lokaler Verabreichung eine nützliche, das Tumorwachstum hemmende Wirkung haben. Diese Annahme wird durch die Ergebnisse der ex vivo Tumorvermessungen und der Tumorpathologie gestützt. Daher sollten weitere Experimente speziell mit Arsentrioxid durchgeführt werden, die Dosis, Formulierung und Applikationsart der Substanz betreffen, um Gewissheit in Bezug auf die Vitalität des als Perfusionsdefekt dargestellten Gewebes zu erhalten, die Reproduzierbarkeit der Befunde zu belegen und eine Abschätzung des möglichen Nutzens für die lokale Tumortherapie zu erlauben.

In many cases, only advanced stage colorectal cancer is diagnosed. At this point, it has often already metastasised to the liver. In these cases, not only the patient’s primary tumor, but also metastases have to be treated. For the treatment of both liver metastases and primary tumors there are local procedures to be offered. The objective of this project was to investigate new methods of local therapy of liver tumors/ metastases, which can be used either as neoadjuvant, adjuvant or stand-alone treatment. It was the aim of this study to investigate minimally invasive local tumor therapy using a low dose of drugs. The study on efficacy and tolerance of this method was conducted in 20 rabbits with implanted VX2 liver tumors. The initial idea was to allow local percutaneous treatment of tumors with therapeutically active substances delivered by drug-coated balloon catheters. In this way, a large tissue surface area will be attained by the increased surface of the balloon through its expansion. In addition, the coating will be sustainably pressed into the tumor tissue. After that, the active substance should be slowly dissolved in the tissue or slowly washed away from its location. The following cytostatics were selected: paclitaxel, arsenic trioxide, 5-fluorouracil, fantolon, bortezomib, doxorubicin and mitoxanthrone. In addition, the drugs were compared with appropriate drug-free controls. The above mentioned substances were tested in vitro for their cytotoxicity against the VX2 tumor cells in culture. The cells were exposed to any substance at four different concentrations (2-32 μmol/l for paclitaxel, arsenic oxide, fantolon, 5-fluorouracil and mitoxanthrone, 10- 25 μmol/l for doxorubicin, 0.1-0.4 μmol/l for bortezomib) for 24, 48 and 72 hours. As a control, tumor cells were incubated without drugs. The total remaining intramitochondrial dehydrogenase activity as a measure of the cellular vitality compared to the control was the lowest for doxorubicin with 12 3% (16 μmol/l after 72 h incubation) and the highest for arsenic trioxide with 52 4% (15 μmol/l after 48 h) when the lowest value was selected for each substance. All tested substances were shown to be effective, and their selection for the investigation in the animal study was based on their physicochemical properties and mechanism of action, as well as on the experience with these substances in previous studies for other indications. Not all test substances selected in this study were shown to be suitable for the coating of balloon catheters, thereby limiting this method of administration in the in vivo experiments. For that reason another mode of administration of these substances had to be chosen. Arsenic trioxide and doxorubicin were injected directly into the tumor using a syringe (four animals per group). Four rabbits were used for each drug to be tested. The applied doses were between 1.57 to 1.78 mg for paclitaxel, 11.5 to 22.0 mg for arsenic trioxide, 1.12 to 1.16 for fantolon and 5.94 to 20.78 for doxorubicin. In the course of the study the doses for doxorubicin and arsenic trioxide could be increased due to their good tolerabi lity and low effect. Half of the animals in the control group were treated with an uncoated balloon catheter (two animals), while the other half of the same group (two animals) received a physiological saline solution by injection to mimic mechanical manipulation of the tumor in treatment with the drugs. The effectiveness of the treatment on tumor growth was controlled after 1-2 weeks by computer tomography during and shortly after injection of a contrast agent. In contrast-enhanced computed tomography the liver tumor is detected by its low blood supply, defined here as perfusion defect, when compared to the healthy liver tissue. A reduction in the size of the perfusion defect after therapy indicates a decrease in the tumor size, while an increase can be attributed to tumor growth or necrosis. Therefore, after dissection TCC staining of vital parts of the tissue with a perfusion defect was performed. Overall, the effect of the investigated substances in vivo did not completely correspond to the results in cell culture experiments. In only two out of twenty animals a reduction of the tumorrelated perfusion defect in the liver was observed: one animal in the group treated with fantolon (-36% of the value measured one week before) and one control animal treated with an uncoated balloon (-6% of the value measured one week before). In all other animals the assessment of the efficacy of the substances is only based on the increase of the perfusion defect. The lowest percentage growth in the perfusion defect was observed in animals treated with paclitaxel (271 ± 186%), followed by animals of the control group (903 ± 925%). The largest increase in the perfusion defect was seen after treatment with arsenic trioxide (3580 ± 4871%), where the largest proportion of the poorly or not perfused liver tissue was necrotic. None of the substances and formulations tested in this study showed the desired local cytotoxic properties in vivo. However, it cannot be excluded that local administration of paclitaxel and arsenic trioxide inhibits tumor growth. This assumption is supported by the results of ex vivo measurements of the tumor size and by pathological examination. Thus, further experiments regarding the dose, formulations and mode of administration should be conducted, especially for arsenic trioxide, in order to demonstrate reproducibility of the findings, gain insight certainty with respect to vitality of the damaged tissue defined as perfusion defect and to assess the potential benefits of these substances for local tumor therapy.