Characterization of peripheral osmoreceptors

Abstract

The extracellular fluid surrounds our cells and supplies them with ions and nutrients. Changes in extracellular fluid osmolality can affect cell integrity, metabolism and function and under extreme conditions can have lethal consequences. Therefore, our body strives to keep extracellular fluid osmolality at a highly stable set-point and a divergence towards either hypotonicity or hypertonicity triggers behavioral and humoral responses. The underlying mechanism for detection of changes in osmolality is called osmoreception. Osmoreceptors have been found both centrally and peripherally. Whereas central osmoreceptors have been well studied, peripheral osmoreceptors have received much less attention. This study is concerned with the analysis of the effect of water-drinking and investigates the role of the sensory innervation of the liver in peripheral osmoreception. Furthermore, the role of the ion channel TRPV4, which has been shown to be involved in osmoreception, is studied. The physiological stimulus for water-drinking in mice has been assessed. To investigate activation of peripheral afferents due to water- drinking, an animal model based on pERK immunostaining has been developed. We observed an increase in ERK activation in hepatic neurons innervating liver blood vessels following water-drinking, which indicated an involvement of the liver in peripheral osmoreception. Employing Ca2+-imaging and whole-cell patch clamp experiments we studied the osmosensitivity of DRG neurons from cervical, thoracic and lumbar spinal regions. Thoracic neurons displayed a significantly higher proportion of osmosensitive cells compared to neurons from other spinal regions. By using a retrograde tracer injected in the liver, we could visualize the liver innervating population of thoracic DRG neurons and found a strikingly high proportion of cells from this population to be osmosensitive. Thus, we could show the involvement of the liver in peripheral osmoreception. Further whole-cell patch clamp experiments demonstrated, that indeed thoracic DRG neurons and not vagal neurons of the nodose ganglia transduce hepatic osmotic stimuli. A large part of this study was concerned with the analysis of TRPV4 -/- mice. It was found, that upon deletion of the TRPV4 gene, water- drinking did not increase pERK levels in hepatic afferents. The population of osmosensitive thoracic DRG neurons from TRPV4 -/- mice was found to be significantly decreased as shown with Ca2+ imaging and whole-cell patch clamp experiments. These results indicated a crucial role of TRPV4 in peripheral osmoreception.

Die Extrazellulärflüssigkeit umgibt unsere Zellen und versorgt sie mit Ionen und Nährstoffen. Eine Änderung der Osmolalität der Extrazellalärflüssigkeit kann Auswirkungen auf die Integrität von Zellen, ihren Metabolismus und ihre Funktion haben und unter extremen Bedingungen kann sie sogar letale Konsequenzen haben. Deshalb ist unser Körper sehr bestrebt, die Osmolalität der Extrazellalärflüssigkeit um einem stabilen Sollwert zu halten. Hypo- und hypertone Abweichungen der Osmolalität vom Sollwert löst hormonale- und verhaltensspezifische Reaktionen aus, die die Osmolalität zurück zum Sollwert regulieren. Der zugrundeliegende Mechanismus zur Detektion von Veränderungen der Osmolalität heisst Osmorezeption. Osmorezeptoren wurden sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem gefunden. Zentrale Osmorezeptoren wurden schon relativ gut studiert, wohingegen peripheren Osmorezeptoren wesentlich weniger Aufmerksamkeit geschenkt wurde. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse des Effekts von Wassertrinken und untersucht insbesondere die Rolle der sensorischen Innervation der Leber in peripherer Osmorezeption. Weiterhin wird die Rolle des TRPV4 Ionenkanals untersucht, von dem bekannt ist, dass er an Osmorezeptionsprozessen beteiligt ist. Der physiologische Stimulus des Wassertrinkens wurde gemessen. Um die Aktivierung peripherer Afferenzen durch Wassertrinken zu untersuchen, entwickelten wir ein Tiermodell, welches auf Immunofärbungen mit pERK basiert. Nach Wassertrinken beobachteten wir einen Anstieg an pERK in Neuronen, die hepatische Blutgefäße innervieren, was auf eine Beteiligung der Leber an peripherer Osmorezeption hindeutet. Weiterhin wurde die Osmosensitivität von DRG Neuronen des cervikalen und lumbaren Bereichs des Rückenmarks, sowie des Thoraxbereiches mittels Ca2+-Imaging und der Patch-Clamp Methode untersucht. Wir fanden einen signifikant größeren Anteil an osmosensitiven Neuronen im Thoraxbereich im Vergleich zu anderen Bereichen des Rückenmarks. Mittels hepatischer Injektion eines retrograden Tracers konnten wir die Leber-innervierende Population an Neuronen des Thoraxbereiches markieren und zeigen, dass ein erheblicher Anteil dieser Poppulation osmosensitive ist, wodurch die Beteiligung der Leber an peripherer Osmoreception nachgewiesen werden konnte. Durch weitere Patch-Clamp Experimente wurde ausserdem gezeigt, dass nicht Neuronen der Nodose Ganglionen, sondern des Thoraxbereiches osmotische Stimuli in der Leber detektieren. Ein großer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit Untersuchungen von TRPV4 -/- Mäusen. Dabei beobachteten wir, dass die Deletion des TRPV4 Genes dazu führt, dass die Menge an pERK in hepatischen Afferenzen nach Wassertrinken nicht mehr ansteigt. Desweiteren war der Anteil an osmosensitiven Neuronen des Thoraxbereiches von TRPV4 -/- Tieren deutlich verringert, wie wir durch Ca2+ Imaging und Patch-Clamp Studien herausfanden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass TRPV4 eine wesentliche Rolle bei der peripheren Osmorezeption spielt.