Präklinische Evaluation der MDM2-p53-FOXM1 Achse als therapeutisches Ziel bei gut differenzierten gastroenteropankreatischen neuroendokrinen Neoplasien

Abstract

Diese Arbeit befasste sich mit der Evaluation einer deregulierten MDM2-p53-FOXM1 Achse als therapeutisches Ziel in gastroenteropankreatischen neuroendokrinen Neoplasien (GEP-NEN). Der Tumorsuppressor p53 ist in gut differenzierten GEP-NEN nur selten mutiert. Er ist jedoch durch aberrante Expression der p53 regulierenden Ubiquitin-Ligase MDM2 häufig funktionell eingeschränkt. Dadurch können transkriptionell reprimierte p53 Zielgene, die als Protoonkogene wirken, wie beispielweise Survivin oder FOXM1 verstärkt exprimiert werden. Diese Arbeit widmete sich zunächst der klinischen Analyse primärer Tumorproben sowie funktioneller Abhängigkeiten in GEP NEN Zelllinien hinsichtlich der Rolle von MDM2 und FOXM1 als Malignitätsmarker in GEP-NEN und leitete daraus therapeutische Ansätze ab. Diese wurden anschließend präklinisch in der Zellkultur bewertet. Die Relevanz der FOXM1 Expression als Malignitätsmarker in GEP-NEN konnte in zwei unabhängigen Kollektiven sowohl mittels Western Blot als auch durch Immunhistochemie nachgewiesen werden. Hier wurde ein deutlicher Zusammenhang zwischen einem Anstieg der Expression von FOXM1 und der Abgrenzung von G1 Tumorstadien hin zu G2 und G3 Tumoren gezeigt, wobei letztere FOXM1 deutlich stärker exprimierten. Ebenso konnte eine verstärkte Expression von FOXM1 und MDM2 in Metastasen im Vergleich zu Primärtumoren gezeigt werden. In Ergänzung zur bereits bekannten regulatorischen Abhängigkeit von FOXM1 durch MDM2 via p53, konnte durch RNA Interferenz in p53 defizienten QGP-1 Zellen gezeigt werden, dass MDM2 FOXM1 auch unabhängig von p53 regulieren kann. Zudem wurde mittels pharmakologischer Modulation mit dem PTEN Inhibitor bpV(HOpic) und dem AKT Inhibitor Triciribin nachgewiesen, dass auch der PI3 Kinase-Weg - als bisher zentrales therapeutisches Ziel für molekulare Therapien in GEP-NEN - einen Einfluss auf die FOXM1 Expression haben kann. Da die Expression von FOXM1 durch Modulation des PI3 Kinase-Weges beeinflusst werden kann, ist es möglich, dass die Trias aus MDM2 Überexpression, Hyperaktivierung des PI3 Kinase-Weges und hoher FOXM1 Expression ein bedeutendes molekulares Muster für die Entstehung von GEP-NEN darstellt. Um diese Markerkombination weiter zu evaluieren, beispielsweise im Hinblick auf die Vorhersagekraft von Metastasierungsereignissen, bedarf es jedoch weiterer intensiver Studien an primärem Tumormaterial. Anschließend wurden drei Proteasominhibitoren, Siomycin A, Bortezomib und Thiostrepton, sowie, als Antagonisten der MDM2-p53 Wechselwirkung, Nutlin-3 und Nutlin-3a auf ihre Wirksamkeit in GEP NEN Zelllinien mittels WST-1 Proliferationsassay, Durchflusszytometrie, Western Blot und Expressionsanalysen charakterisiert. Die beste Wirksamkeit im Sinne einer antiproliferativen Wirkung und Induktion von Apoptose wiesen Siomycin A und Bortezomib auf. Dieses konnte mittels Proliferationsassay und Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Es zeigte sich zudem in den Expressionsanalysen und im Western Blot eine deutliche Reduktion der Transkription von Genen, die die Proliferation und die DNA Reparatur beeinflussen, sowie von FOXM1 und seiner Zielgene. Für Bortezomib zeigten die Genexpressions- und Western Blot Analysen, dass die Inhibition der DNA Reparatur in BON Zellen auch bei Induktion von genotoxischem Stress mittels Cisplatin stabil blieb und somit zu verstärktem DNA-Schaden induziertem Stress, sowie zu verstärkter Apoptoseinduktion führte. Da auch die Proliferationsstudien quantitativ synergistische Effekte in dieser Zelllinie zeigten, kann von einem sensibilisierenden Effekt gegenüber Cisplatin ausgegangen werden. Für die Kombination von Proteasominhibition mit Chemotherapie ergab sich ein verstärkender Effekt bei gentechnischer sowie pharmakologischer Reduktion der FOXM1 Expression, hier allerdings nur bei den p53 mutierten Zelllinien. Die p53 Wildtyp (wt) Zelllinie sprach bereits sehr gut auf alle Monotherapien an, zeigte jedoch keine verstärkenden Effekte bei zusätzlicher Induktion von zellulärem Stress durch Cisplatin. Ein Grund dafür könnte sein, dass FOXM1 hier weitestgehend schwach exprimiert und zytoplasmatisch lokalisiert war und entsprechend grundsätzlich weniger therapeutische Angriffsfläche bestand. Bei Verfügbarkeit einer weiteren TP53 wt Zelllinie oder nach Knockdown von p53 in KRJ-I muss geklärt werden, ob dieser Effekt zelllinienspezifisch nur bei KRJ-I auftritt, oder ein generelles Charakteristikum von p53 wt Zelllinien in diesem Kontext darstellt. Zudem sollte die Rolle von p53 in der Chemotherapieantwort unter Proteasominhibition in GEP-NEN näher untersucht werden, da diese vor allem für die Kombinationstherapie von p53 Wildtyp NET-G3 versus p53 mutierten NEC-G3 relevant sein könnte. Die Kausalität zwischen den Wirkmechanismen der Proteasominhibition mit der Inhibition von FOXM1 wurde in der Literatur vielfach als maßgeblich beschrieben. Obwohl Proteasominhibition FOXM1 und seine Zielgene inhibiert, werfen die Studien in dieser Arbeit die Frage auf, ob die induzierten Mechanismen wirklich maßgeblich FOXM1-abhängig sind, oder die Expression von FOXM1 nicht vielmehr als Folge einer Proliferationsinhibition auftritt. Im Vergleich von Bortezomib mit FOXM1 Knockdown Zellen ergaben sich lediglich Übereinstimmungen in der Expression Zellzyklus-assoziierter Gene. Die veränderte Regulation einer Vielzahl von FOXM1 Zielproteinen reicht an dieser Stelle jedoch nicht aus und könnte letztlich eine Folge verminderter Proliferation sein. Zum erwünschten molekularbiologischen Erkenntnisgewinn im Sinne der initialen Thesen konnte dieser Teil der Arbeit nicht beitragen. Er liefert jedoch eine starke Rationale zur weitergehenden präklinischen Erforschung von Bortezomib, vor allem als Radiosensitizer. Daher wurde ein alternativer Ansatz gewählt, in dem eine Stabilisierung von p53 gegenüber MDM2 erreicht werden sollte. Auch die Verwendung von Nutlinen zeigte (entsprechend der Wirkungsweise von Nutlin) bei den p53 wt KRJ-I Zellen einen antiproliferativen Effekt. Dieser war funktionell durch die Induktion von p53 Zielgenen, Inhibition von FOXM1 Expression und Aktivität sowie durch Reduktion von DNA Reparaturmechanismen und synergistische Kombinationseffekte mit Cisplatin gekennzeichnet. Auf Basis der vorliegenden in vitro Ergebnisse sollte somit die Proteasominhibition als chemotherapie-sensibilisierend in p53- mutierten GEP-NEN weiter präklinisch erforscht werden. Hier kämen vor allem höher proliferative Tumore infrage, bei denen platinbasierte Chemotherapie tatsächlich auch bereits mit mäßigem Erfolg angewendet wird. Interessant wäre überdies die weitere Evaluierung dieses therapeutischen Ansatzes in Kombination mit Radiotherapie oder PRRT. Für niedrig proliferative p53 Wildtyp Tumore sollte hingegen die Proteasominhibition in Monotherapie, bzw. die Inhibition der MDM2-p53 Interaktion weiter präklinisch erforscht werden. Eine Stratifikation von Patientensubgruppen, beispielsweise nach p53 Genotyp und FOXM1 Expression, sollte in möglichen frühen klinischen Studien unbedingt vorgenommen werden Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass sich FOXM1 als Progressionsmarker in GEP-NEN eignet. Zudem konnte aus anwendungsorientierter Sicht die Wirksamkeit von Proteasominhibitoren in Hinsicht auf eine mögliche GEP-NEN Therapie bestätigt werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass MDM2-inhibitorische Ansätze in GEP NEN effektiv sind, wenn die notwendigen molekularen Voraussetzungen vorliegen. Die Ergebnisse zu beiden therapeutischen Ansätzen können nun die Grundlage für weiterführende translationale Studien sein.

Therapeutic options are often limited in patients diagnosed with gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms (GEP-NEN) thus the role of deregulated proteins of the p53 network as therapeutic targets was addressed in this work. The major objective was therefore to identify and assess novel targeted treatment strategies for GEP-NEN in vitro Unless tumor suppressor p53 is rarely mutated in GEP-NEN, the aberrant expression of its upstream regulator MDM2 results in a functional loss of p53 and a dysregulation of transcriptionally repressed protooncogenic p53 target genes. The p53 regulator MDM2, an E3 ubiquitin ligase, and the p53 transcriptional target FOXM1 were analyzed in primary GEP-NEN material in order to describe potential roles as malignancy markers and further to derive and assess novel therapeutic approaches in vitro. We demonstrated through immunohistochemistry and western blots analysis that the expression of FOXM1 may serve as a new progression marker, as FOXM1 expression was associated with GEP-NEN disease grading. Here, FOXM1 expression was found significantly elevated in G2 and G3 graded tumors. We further demonstrated a higher expression of FOXM1 and MDM2 in metastatic tissue related to primary tumors. We also demonstrated that the loss of transcriptional repression of FOXM1 due to MDM2 ubiquitin-mediated proteasomal degradation of p53 may not be the only regulatory interaction of FOXM1 and MDM2. The results of RNA interference of MDM2 in p53 deficient QGP-1 cells suggests that FOXM1 may be also regulated by MDM2 in a p53-independent manner. Furthmore, modulation of the PI3 kinase pathway by inhibition through triciribin and activation through the PTEN inhibitor bpV(HOpic) proved a regulatory dependency of FOXM1 expression from a frequent hyperactivated PI3K signaling in GEP-NEN. Subsequently, three proteasome inhibitors, siomycin A, bortezomib and thiostreptone, as well as antagonists of the MDM2-p53 interaction, namely nutlin-3 and nutlin-3a, were preclinically assessed in vitro by proliferation assay, flow cytometry, western blot and expression analysis. We could show that the proteasome inhibitors siomycin A and bortezomib induced anti-proliferative as well as pro-apoptotic effects in all GEP-NEN cell lines, as demonstrated by proliferation studies and induction of cell cycle arrest, increased apoptosis, and altered expression of cell cycle and DNA repair related genes. Both substances further decreased the expression of FOXM1 itself and of FOXM1 target genes. Gene expression and western blot analyses of BON cells treated with bortezomib combined with genotoxic stress induction by cisplatin induced enhanced DNA damage stress and pro-apoptotic effects. Including the results of proliferation assays after combined treatment, synergistic genotoxic effects of bortezomib and cisplatin were concluded for three GEP-NEN cell lines with TP53 mutations. The p53 wild type cell line showed a very strong response to all monotherapeutic treatments with no enhanced effect by additional induction of cellular stress by the use of cisplatin. This effect might be dependent on the overall low expression of FOXM1 in this cell line and should be verified by knockdown of p53 or when another p53 wild type GEP-NEN cell line is available. The functional role of p53 in the response to chemotherapy combined with proteasome inhibition might also be interesting in the context of treating wild type G3-NET versus mutated G3-NEC tumors. This study rises concerns about the operative role of FOXM1 in the response to proteasome inhibitors. The gene expression pattern after bortezomib treatment or FOXM1 knockdown was only comparable for cell cycle associated genes. The inhibition of FOXM1 and its target genes might thus not contribute to the induced mechanisms, but might be a result of reduced proliferation. Nevertheless, it provides interesting preclinical data for further assessing bortezomib in GEP-NEN, especially as radiosensitizer. In order to explore a more target-related approach, we introduced a treatment alternative through re-stabilization of p53. This alternative approach, the treatment of the p53 wild type GEP-NEN cell line KRJ-I with the MDM2 antagonist nutlin, resulted in a reduced proliferation, induction of p53 target genes, inhibition of FOXM1 expression, and synergistic anti- proliferative effects in combination with cisplatin. The decreased expression of DNA-damage related genes could also be demonstrated after nutlin treatment. Finally, more than 90% of the genes affected by both proteasome inhibition and MDM2 antagonism, were transcriptional targets of FOXM1. Based on these in vitro results, the chemo- and radiosensitizing effect of proteasome inhibitors should be further evaluated for the treatment of p53 mutated GEP-NEN. Especially patients with higher proliferative tumors might benefit, because chemotherapy and PRRT are already established treatment options. For slowly proliferating p53 wt tumors, proteasome inhibition as monotherapy and inhibition of MDM2 should be further assessed. In both cases, the determination of a patients genotype is essential and a TP53 genotype stratification should be included in early clinical studies as well. In conclusion, FOXM1 might serve as novel grading marker in GEP-NEN. Despite the inability to demonstrate a clear direct association of proteasome inhibition with FOXM1 activity, the therapeutic potential of proteasome inhibition for GEP-NEN is presented herein. Further, MDM2 inhibitory approaches are possible when the status of p53 is considered in molecular pre-screening. The results of this work provide the rationale for further translational studies on bortezomib and nutlin for the treatment of GEP-NEN disease.