In-vivo-Imaging der Metastasierung beim kolorektalen Karzinom in einem Xenograft-Mausmodell: Einfluss des neuidentifizierten Metastasierungsgens MACC1

Abstract

Die Überlebensrate beim kolorektalen Karzinom wird stark durch das Auftreten von Metastasen beeinflusst. Bisher wurden zahlreiche molekulare Marker zur Erkennung der frühzeitigen Metastasierung evaluiert, um Niedrig-Risiko- und Hoch-Risiko-Patienten gerade in den frühen Tumorstadien eindeutiger zu unterscheiden. Unsere Arbeitsgruppe hat MACC1 als neues metastasierungsinduzierendes Gen identifiziert. MACC1 ist ein wichtiger prognostischer Marker für die Metastasierung beim kolorektalen Karzinom. Es induziert sowohl in vitro Proliferation, Migration und Invasion als auch in vivo die Metastasierung, wie durch Endpunktbestimmungen in verschiedenen Mausmodellen gezeigt werden konnte. MACC1 interagiert mit der Bindungsstelle von SP1, einem Transkriptionsfaktor am Met-Promotor, und induziert so die Met- Expression. Über den HGF/Met-Signalweg wird die Expression von MACC1 gesteigert und die Translokation von MACC1 in den Nucleus gesteuert. Die Domänenstruktur prädestiniert MACC1 als Signaltransduktionsmolekül. Vor allem die SH3-Domäne ist für die Funktion von MACC1 von besonderer Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war das Imaging der MACC1-induzierten Metastasierung in einem Xenograft-Mausmodell und die Evaluation des Einflusses der SH3-Domäne auf die Funktion von MACC1. Dazu wurden Konstrukte generiert, die das Reportergen Luciferase und MACC1 vom Wildtyp bzw. mutiertes MACC1 (MACC1ΔSH3) in einem gemeinsamen pIRES-Vektor enthielten. Zusätzlich diente ein Konstrukt, welches ausschließlich das Reportergen Luciferase enthielt, als Kontrollkonstrukt. Der Erfolg der Klonierung wurde sowohl durch den Kontrollverdau mittels spezifischer Restriktionsenzyme als auch durch Sequenzierungen bestätigt. Die Konstrukte wurden in humane Kolonkarzinomzellen, die intrinsisch eine äußerst geringe Expression von MACC1 aufweisen, stabil transfiziert. Die Expressionsanalysen der Klone erfolgte durch Messungen der Luciferaseaktivität mittels Biolumineszenz, durch quantitative real-time RT-PCR Bestimmungen von MACC1 und durch Western-Blots. Durch Migrations- und Invasions-Assays wurde die Funktionalität der transfizierten Klone evaluiert. Durch diese in vitro Voruntersuchungen konnte eine Auswahl der effektivsten Klone getroffen werden, die für das In-vivo- Imaging benutzt wurden. Die transfizierten Zellklone wurden den Mäusen intrasplenal injiziert und das Tumorwachstum und die Metastasierung mehrmals wöchentlich mittels Biolumineszenzmessungen mit einer hoch sensitiven CCD- Kamera beobachtet. Durch dieses Imaging konnten das Wachstum des Primärtumors und die Entwicklung von Metastasen zeitlich und räumlich auf nicht invasivem Weg erfolgreich nachverfolgt werden. Mit diesem Mausmodell soll zukünftig die Grundlage für eine exakte Analyse von MACC1-spezifischen Interventionsstrategien geschaffen werden. Die Generierung eines Konstruktes mit dem Reportergen Luciferase und MACC1 in einem gemeinsamen Vektor bietet die Möglichkeit, die Effektivität der Ko-Transfektion zweier Transgene und deren gemeinsame Expression in den stabilen Klonen deutlich zu erhöhen im Vergleich zu der Transfektion mittels zweier unabhängiger Konstrukte, wie es in bisherigen Projekten durchgeführt wurde. Die Expression zweier Transgene in einem gemeinsamen Konstrukt kann Auswirkungen auf die biologische Aktivität der Zielproteine haben, wie es vor allem bei Anwendung von Fusionsproteinvektoren zu befürchten wäre. Dass dies unter Verwendung der IRES-Konstrukte nicht der Fall ist, wurde durch In-vitro- und In-vivo-Analysen sichergestellt und mit den Ergebnissen von bisherigen Projekten der Arbeitsgruppe in Bezug auf die MACC1-Aktivität verglichen. Die Verwendung der klonierten IRES-Konstrukte bietet außerdem die Möglichkeit über das Biolumineszenzsignal den therapeutischen Nutzen von MACC1-shRNA, -Inhibitoren oder -Antikörpern zu untersuchen. Dadurch soll es möglich sein, effektive Interventionsstrategien gegen die MACC1-induzierte Metastasierung zu entwickeln. In Zukunft soll dies fester Bestandteil des klinischen Alltags darstellen, um eine Prävention der Metastasierung sowohl beim kolorektalen Karzinom als auch bei anderen Krebsentitäten zu erzielen.

The overall survival in case of colorectal cancer strongly depends on the occurrence of metastases. A range of molecular markers were evaluated for metastasis prediction and to distinguish between low-risk- and high-risk- patients especially in early tumor stages. Our workgroup previously identified the gene metastasis-associated in colon cancer-1 (MACC1) and demonstrated its important role for metastasis prediction in colorectal cancer. MACC1 induces cell motility and proliferation in vitro as well as metastasis in several mouse models. MACC1 plays a key role in activating the HGF/Met pathway by transcriptionally controlling the expression of the gene encoding the receptor tyrosine kinase Met. Furthermore MACC1 expression itself is increased by activation of the MAPK signaling pathway. This leads to a positive feedback loop with respect to MACC1 induced cell motility, tumor growth and metastasis. MACC1 encodes a protein of 852 amino acids that harbors, besides of other motifs, an SH3-domain together with a proline-rich motif (PXXP) which predestine MACC1 as signal transduction molecule via protein-protein interaction. Here we report non-invasive real-time imaging of MACC1 induced metastasis in a xenograft mouse model and evaluation of the SH3-domain with respect to the function of MACC1. Therefore we generated novel bicistronic IRES vectors expressing the reporter gene firefly luciferase simultaneously with wildtype MACC1 or mutated MACC1 (MACC1ΔSH3) in order to ensure a direct correlation of the bioluminescence signal with the MACC1 expression level. An additional construct expressing the reportergene luciferase exclusively served as control. The success of cloning was confirmed by control digestions and by sequencing. We stably transfected MACC1 endogenously low expressing colon cancer cells with the new constructs. Expression analyses of the transfectants were performed by luciferase activity assay, quantitative real time RT-PCR and western blot. The metastatic parameters of the new transfectants were evaluated by migration and invasion assays. By these in vitro analyses one clone per group was selected and used for the following in vivo imaging. Transfected tumor cells were intrasplenically transplanted into mice and imaged several times a week by using a high sensitive CCD camera detecting the bioluminescence signal. This imaging ensured non invasive analyses of the primary tumor growth and the development of metastases. The new mouse model enables an exact study of MACC1 specific intervention strategies in future. Creating a construct expressing the reportergene luciferase and MACC1 in one common IRES vector enhances the co-transfection and -expression of two transgenes compared to the transfection of two independent constructs as used in projects before. Since we used newly generated constructs in this project we needed to ensure the correct biological function of the transfectants by in vitro and in vivo analyses. The application of the newly generated IRES constructs enables us to evaluate the therapeutic value of MACC1 inhibitors or antibodies. By this, effective intervention strategies against the MACC1 induced metastasis formation can be developed. In future this should be a part of the clinical everyday life to improve the prognosis of colorectal cancer and even for other cancer entities.