DNA-Methylierung des Neuropeptid Y-Genpromotors im Hypothalamus neonatal überernährter Ratten

Abstract

Übergewicht und Adipositas stellen mit ihrem epidemischen Auftreten die Betroffenen und die Gesellschaft vor schnell wachsende Herausforderungen. Klinische und epidemiologische Beobachtungen zeigen, daß die erhöhte neonatale Gewichtszunahme mit Adipositas im Erwachsenenalter assoziiert ist. Zur Erforschung der Pathogenese dieses Phänomens existiert das gut etablierte Tiermodell der „kleinen Würfe“, in dem bei der Ratte durch neonatale Überernährung Hyperphagie, erhöhtes Körpergewicht und diabetogene Stoffwechselveränderungen hervorgerufen werden. Diese Veränderungen persistieren bis in das adulte Alter. Bei diesem Modell kann von einer neonatalen Fehlprogrammierung von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht gesprochen werden. Der potenteste orexigene hypothalamische Neurotransmitter ist Neuropeptid Y (NPY). Es gibt zahlreiche Hinweise auf eine Fehlregulation des NPYergen Systems im Hypothalamus neonatal überernährter Ratten im Sinne permanent erhöhter Aktivität und einer Resistenz gegenüber Leptin und Insulin. Ein möglicher Mechanismus einer derartigen persistierenden Fehlregulation könnte die neonatal erworbene, epigenetische Programmierung durch alterierte DNA-Methylierung sein. So ist exemplarisch gezeigt worden, daß das mütterliche Verhalten durch Veränderung der DNA-Methylierung im Promotor des Glucocorticoid-Rezeptors dessen Expression dauerhaft beeinflußte. Der NPY- Promotor könnte prinzipiell ebenso für DNA-Methylierung empfänglich sein, da er sowohl eine CpG-Insel als auch potentiell durch Methylierung modulierbare Transkriptionsfaktorbindungsstellen enthält. Die vorliegende Studie sollte somit die Arbeitshypothese überprüfen, ob eine veränderte DNA-Methylierung im hypothalamischen NPY-Promotor eine Rolle in der Pathogenese der durch Überernährung induzierten Fehlregulation von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht spielt, und ob sich eine Beziehung zur Expression der NPY-mRNA sowie zu peripheren Stoffwechselparametern zeigt. Zur Untersuchung des Methylierungsstatus wurde die Methode der Bisulfitbehandlung mit subsequenter Klonierung und Sequenzierung als Goldstandard gewählt, die eine exakte Aussage über den Methylierungsgrad aller Cytosine der untersuchten Sequenz gestattet. Analysiert wurde die Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen -246 und -1 mit einer Gesamtzahl von 7560 Cytosinpositionen bei insgesamt 108 Klonen pro Gruppe. Die Expression der NPY-mRNA wurde mittels RT-PCR bestimmt. Neonatal überernährte Ratten waren am 21. Lebenstag bei erhöhtem absolutem und relativem Körpergewicht hyperleptinämisch und hyperinsulinämisch. Der hypothalamische NPY-Promotor dieser Tiere zeigte im Vergleich zur normalernährten Kontrollgruppe keinen signifikanten Unterschied im Methylierungsstatus aller Cytosine (0,23% vs. 0,26%) sowie der Cytosine in CpG-Positionen (0,38% vs. 0,55%) und war insgesamt hypomethyliert. Die Expression der NPY-mRNA wies weder einen signifikanten Gruppenunterschied noch eine Assoziation zum Methylierungsgrad des NPY-Promotors auf. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die DNA-Methylierung im untersuchten Bereich des NPY-Promotors an der Fehlprogrammierung von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht bei neonatal überernährten Ratten nicht beteiligt ist. Der NPY-Promotor ist sowohl in der Experimental- als auch der Kontrollgruppe hypomethyliert, was ein Hinweis dafür sein könnte, daß das evolutionär stark konservierte und überlebenswichtige NPY vor einer Regulation durch DNA-Methylierung geschützt ist. Die fehlende Down-Regulation der NPY-mRNA trotz Hyperleptinämie und Hyperinsulinämie bekräftigt die Hypothese einer Resistenz des NPYergen Systems gegenüber Leptin und Insulin und ist konsistent mit der vorbeschriebenen fehlenden Down-Regulation bzw. Aktivitätssteigerung auf der Ebene des Peptids, der Neuronendichte und der Elektrophysiologie. Der Pathomechanismus dieser sich durch die Leptin- und Insulinresistenz manifestierenden Fehlprogrammierung von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht könnte möglicherweise im Bereich der Signaltransduktion und/oder durch DNA- Methylierung im Promotorbereich anderer, methylierungsempfindlicherer Neuropeptide stattfinden, die mit dem NPYergen System interagieren und dessen Aktivität beeinflussen. Gruppenübergreifend fand sich eine positive signifikante Korrelation zwischen der Blutglukose und dem Methylierungsgrad im Promotor von NPY (r = 0,58; p < 0,05). Diese deutliche Korrelation könnte Ausdruck eines mechanistischen Einflußes der extrazellulären Glukosekonzentration auf die Methylierung von DNA sein und daher neue pathophysiologische Erklärungsansätze und Arbeitshypothesen bei hyperglykämischen Situationen erlauben. Diese Arbeit bietet die Basis für weitere Untersuchungen von epigenetischen Veränderungen im Hypothalamus neonatal überernährter Ratten. Der Untersuchung des Pathomechanismus der neonatal ernährungsabhängig erworbenen Disposition zu Übergewicht und Adipositas kommt eine eminente Bedeutung zu, denn nur durch genaue Kenntnis der Ätiologie können gezielte Maßnahmen zur Primärprävention dieser Epidemie etabliert werden.

The obesity epidemic is an ever growing challenge for society and health systems. Clinical and epidemiological observations show that increased neonatal weight gain is associated with obesity in adulthood. To study the pathogenesis of this phenomenon, the rat model of "small litters" has been established, in which neonatal overnutrition induces hyperphagia, increased body weight and diabetogenic metabolic changes. These changes persist until and throughout adult age. We suggest that this phenotype results from neonatal “malprogramming” of the regulation of food intake and body weight. The most potent orexigenic hypothalamic neurotransmitter is neuropeptide Y (NPY). There are numerous indications of a defective regulation of the hypothalamic NPYergic system in neonatally overfed rats in the sense of a permanently increased activity of this system, resulting from resistance to leptin and insulin. A possible mechanism of such persistent dysregulation could be neonatally acquired altered epigenetic programming by DNA methylation. The NPY promoter could principally be susceptible for DNA methylation, as it exhibits both a CpG island as well as transcription factor binding sites that have been shown to be sensitive to DNA methylation. The present study therefore aims to investigate the hypothesis that altered DNA methylation in the hypothalamic NPY promoter may play a role in the pathogenesis of the nutritionally-induced dysregulation of food intake and body weight, and whether a relationship with the expression of NPY mRNA and peripheral metabolic parameters exists. To investigate the methylation status, bisulfite treatment with subsequent cloning and sequencing was applied, currently representing the gold standard that allows a precise statement about the degree of methylation of all cytosines of the investigated sequence. The nucleotide sequence between -246 and -1 with a total of 7560 Cytosine positions and a total of 108 clones per group has been analyzed. The expression of NPY mRNA was determined using RT- PCR. On day 21 of life, neonatally overfed rats exhibited increased absolute and relative body weight and were hyperleptinemic as well as hyperinsulinemic. The hypothalamic NPY promoter of these animals showed - compared to the normally fed control group - no significant difference in methylation status of all cytosines (0.23% vs. 0.26%) nor of the cytosines in CpG positions (0.38% vs. 0.55%) and was generally hypomethylated. The expression of NPY mRNA showed neither a significant group difference nor an association with the degree of methylation of the NPY promoter. These results imply that DNA methylation in the investigated region of the NPY promoter is not involved in the malprogramming of food intake and body weight in neonatally overfed rats. The NPY promoter was hypomethylated in both the experimental and the control group, which might indicate that NPY is evolutionarily conserved and protected against modification by DNA methylation. The lack of down-regulation of the NPY mRNA in spite of hyperleptinemia and hyperinsulinemia confirmed the hypothesis of a resistance of the NPYergic system to leptin and insulin, and is consistent with the previously described lack of down-regulation or increase in activity at the level of the NPY peptide, the density of NPYergic neurons and their electrophysiological activity. The mechanism of the malprogramming of food intake and body weight mediated by leptin and insulin resistance could possibly be located in the domain of signal transduction and/or by DNA methylation in the promoter region of other neuropeptides that interact with the NPYergic system and influence its activity. Across groups, there was a significant positive correlation between the blood glucose level and the degree of methylation in the NPY promoter (r = 0.58, p <0.05). This significant correlation might illustrate a mechanistic influence of extracellular glucose concentration on the methylation of DNA and therefore allow for novel pathophysiological explanations and working hypotheses in hyperglycemic conditions. This study provides the basis for further work on epigenetic changes in the hypothalamus of neonatally overfed rats. Additional research on the pathogenesis of nutritionally acquired predisposition to overweight and obesity is of utmost importance, because specific measures for primary prevention of this epidemic can only be established if precise knowledge about its etiology exists.