Investigations on the quantitative and qualitative protein excretion in urine of dogs with Severe Inflammatory Response Syndrome (SIRS)

Abstract

In response to severe injury or illness, inflammatory mediators initiate a systemic proinflammatory reaction, which is in turn attenuated or counteracted by the activation of modulating anti-inflammatory mechanisms. Severe inflammatory response syndrome (SIRS) is the state that occurs when an imbalance arises between pro- and anti-inflammatory responses. As a consequence of SIRS, endothelium cells are activated, vascular permeability is increased and vasodilatation, hypovolaemia, hypotension and tissue hypoxia occur. Increased renal filtration of plasma proteins is believed to result from these processes. The definition and diagnostic criteria for SIRS in humans, as developed in 1992, has recently been adapted by veterinarians for the recognition of SIRS in dogs. In the current study, 39 dogs with SIRS and 15 healthy dogs were examined for the presence, quantity and quality of proteins in their urine. Urine and blood samples were obtained from the diseased dogs on admission to a veterinary hospital as well as 24 (n=16) and 48 (n=24) hours thereafter, whenever possible. Urinalysis was conducted for total protein content and creatinine in order to calculate the urinary protein to creatinine ratio (UPC). Using ELISA, urinary albumin and RBP levels were also quantified and the ratios, albumin to urinary creatinine (UAC) and RBP to urinary creatinine (URBPC) were calculated. SDSPAGE was conducted for each dog to further identify the proteinuric pattern as indicative of low molecular weight (LMW) or middle molecular / high molecular weight (MMW/HMW) proteinuria. Furthermore, reference ranges for the level of urinary RBP and the URBPC were defined which could be used to help further establish reference values for future studies. This study showed that proteinuria is a common occurrence in dogs identified as having SIRS. Diseased dogs had significantly much higher levels for excretion of total urinary protein, UPC, albumin and RBP compared to the healthy dogs. 27 diseased dogs (69%) had a UPC > 0.5, 25 dogs (64%) had a UAC > 30 mg/g indicating microalbuminuria to overt proteinuria, whilst 36 dogs (92%) had a URBPC level above the defined upper limit of 33.3 μg/g. The incidence of abnormally high RBP in urine, regardless of whether or not UPC or albumin values were increased, indicated that an element of tubular malfunction was present in almost all diseased dogs. Whilst the UPC and UAC levels were significantly higher at admission than 48 hours later, this was not found for RBP, indicating that although glomerular proteinuria begins to subside within this time, tubular impairment may have a longer duration. The protein patterns obtained through visual inspection of SDS-PAGE showed great difference between the healthy and diseased dogs. The dogs with SIRS had a total of 11 different bands. Although a band in the range 60-70 kDa dominated, occurring in 36 dogs (92%), 58% of the total counted bands were in the LMW range whilst 42% were MMW/HMW. In the SDS-PAGE from the healthy dogs, 3 different bands were visible and only 45% of total counted bands were LMW. Through visual evaluation of the SDS-PAGE, all healthy dogs were deemed to have a physiological pattern. Of the diseased dogs, 11 (28%) exhibited an electrophoresis pattern indicative of tubular proteinuria, 18 (46%) had patterns suggesting mixed proteinuria, 2 (5%) had patterns indicating glomerular origins and 8 dogs (21%) were deemed to have physiological patterns. Previously reported gender-specific proteinuric differences were evident between entire healthy males and the remaining healthy dogs in this study. This was seen through the significantly higher UPC and higher number and intensity of specific LMW bands in urine from the healthy males compared with the other healthy dogs. Although 18 of 19 entire diseased dogs exhibited these specific bands, the generally higher incidence of LMW bands in urine of diseased dogs made an identification of gender specific patterns difficult. The higher level of proteinuria in the diseased dogs may also have masked possible genderspecific characteristics as no difference in UPC was observed between entire males and others. The search for differences in urinary protein excretion between survivors (n=26) and nonsurvivors (n=13) proved not remarkable as no significant differences were found between survivors and non-survivors, neither for proteinuria at admission nor on day 2. Although it appears that SIRS significantly influences renal protein filtration and reabsorption in dogs, correlations between the occurrence of acute proteinuria and mortality and proteinuria severity with mortality were not apparent. Of interest for future investigations is whether increasing or subsiding levels of proteinuria during the early stages of SIRS and in particular, individual trends in proteinuria of glomerular or tubular origin, could have implications for mortality prediction in dogs. Further investigation involving a larger patient collective would be valuable in the search for markers for the severity of a systemic inflammatory response and for evaluating prognosis in dogs with SIRS.

Die Ausscheidung von Plasmaproteinen in den Urin ist sowohl von anatomischen und physiologischen Charakteristika der Nephrone, als auch von den molekularen Eigenschaften der Proteine selbst abhängig. Im Wesentlichen bestimmen folgende Faktoren das Schicksal der Proteine während der Passage durch die Glomeruli: (1) die Porengröße der dreischichtigen glomerulären Filtrationsmembran, (2) die Polarität der Membran, die eine Rolle in der strukturellen Aufrechterhaltung dieser Schichten spielt und (3) die Ladung und Molekular- gewicht der Proteine. Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht (LMW Proteine < 60 kDa) sind relativ frei filtrierbar, für mittelgroße Proteine (MMW 60-80kDa) ist eine Passage vor allem durch die polyanionische Oberfläche stark limitiert und hochmolekulare Proteine (HMW > 80kDa) können unter physiologischen Bedingungen die Filtrationsmembran nicht passieren. Proteine, die durch die glomeruläre Filtrationsmembran gelangen, werden fast vollständig mittels rezeptorvermittelter Endozytose in den proximalen Nierentubuli rückresorbiert. Die Membranrezeptoren Megalin und Cubilin sind hierfür verantwortlich. Der überwiegende Anteil der im Endharn physiologisch ausgeschiedenen Proteine wird im distalen Tubulusbereich synthetisiert und sezerniert. Auf renaler Ebene kommt es vor allem zu einer Proteinurie, wenn die strukturelle Integrität der glomerulären Filtrationsmembran beschädigt ist und erhöhte Mengen an MMW- und LMW-Proteinen diese passieren können und/oder die Rückresorptionsmechanismen in den Nierentubuli eingeschränkt oder überfordert sind. Zusätzlich können prä- oder postrenale Ursachen sowie eine Kombination dieser Mechanismen zu einer Proteinurie führen. Die Molekulargröße der Proteine im Urin gibt Hinweise auf die Lokalisation der Läsion oder Dysfunktion. Erhöhtes Vorkommen von z.B. Albumin (einem MMW Protein) im Endharn deutet auf Läsionen im Glomerulusbereich hin, wohingegen die Ausscheidung hoher Mengen von Retinol- Bindungsprotein (ein LMW Protein) charakteristisch für Tubulusläsionen ist. Als Antwort des Organismus auf Traumata oder schwere Erkrankungen kommt es zur schnellen Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Interleukinen in das Blut. Proinflammatorische Mediatoren wie z.B. IL-1, IL-6 und TNF-α reagieren an Oberflächenrezeptoren verschiedener Zellen wie Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, T-Lymphozyten und Endothelzellen, die ihrerseits die immunologischen, pathophysiologischen und klinischen Zeichen einer inflammatorischen Antwort hervorrufen. Um eine stark überschießende Reaktion zu verhindern, sollte die systemische inflammatorische Reaktion schon nach kurzer Zeit durch die Freisetzung von anti-inflammatorischen Mediatoren gebremst werden. Ist die ursprüngliche imflammatorische Reaktion zu stark, oder das Gleichgewicht zwischen pro- und antiinflammatorischen Reaktionen gestört, entwickelt sich ein Zustand, der „Systemic Inflammatory Response Syndrome“ (SIRS) genannt wird. Die genauen Pathomechanismen sind noch nicht vollständig geklärt, jedoch wird angenommen, dass bei einem SIRS inflammatorische Mediatoren und Immunzellen für die Aktivierung von Endothelzellen verantwortlich sind, und somit zu Vasodilatation, erhöhter Gefäßpermeabilität, Hypovolämie, Hypotension und Gewebshypoxie führen. Dies kann zur Schädigung der anatomischen Struktur und Einschränkung der physiologischen Funktion der Nieren führen, so dass letztendlich erhöhte Mengen von Plasmaproteinen über den Urin verloren gehen können. In der Humanmedizin wurde eine Definition für SIRS sowie klinische Kriterien zur Erkennung von SIRS 1992 international festgelegt. Diese Kriterien wurden für die Veterinärmedizin adaptiert. Das Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob (1) SIRS bei Hunden zur Proteinurie führt, (2) ob Proteinmuster erkannt werden können, die auf eine glomeruläre oder tubuläre Dysfunktion rückschliessen lassen und (3) ob die Proteinurie als prognostischer Marker verwendet werden kann. Fünfzehn gesunde und 39 kranke Hunde gingen in die Studie ein. Diesen Hunden wurden bei Erstvorstellung Harn- und Blutproben entnommen und in der Gruppe der erkrankten Tiere wurden, wenn möglich, zusätzliche Harnproben nach 24 (n=16) bzw. 48 (n=24) Stunden entnommen. Mittels der Bradford-Analyse und der alkalischen Pikrat-Methode wurden jeweils Gesamtprotein und Kreatinin im Harn gemessen und ein Urinprotein-Urinkreatinin-Quotient (UPC) gebildet. Ein ELISA wurde zur Bestimmung der Urinproteinmengen von Albumin und Retinol-Bindungsprotein (RBP) verwendet und die Quotienten Albumin-Kreatinin (UAC) und RBP-Kreatinin (URBPC) errechnet. Die Proteinmuster wurden mittels einer SDS Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Die schon von anderen Autoren beschriebenen geschlechtsspezifischen Unterschiede in Proteinuriemustern wurde auch in dieser Studie beim Vergleich der Werte von gesunden nicht kastrierten Rüden und den übrigen gesunden Hunden deutlich. Sowohl UPC als auch die Anzahl und Intensität spezifischer LMW-Banden waren bei diesen Rüden deutlich höher. Obwohl bei 18 von 19 kranken nicht kastrierten Rüden die spezifischen Banden ebenfalls vorhanden waren, konnten geschlechtsspezifische Unterschiede aufgrund der insgesamtdeutlich erhöhten Anzahl von LMW-Banden in der Gruppe der kranken Hunde nicht identifiziert werden. Auch waren bei den UPC-Werten der nicht kastrierten Rüden und der restlichen erkrankten Hunde keine Unterschiede vorhanden und es ist anzunehmen, daß mögliche geschlechtsspezifische Charakteristika durch die stärker ausgeprägte Proteinurie bei erkrankten Hunden verdeckt worden sind. Die Studie konnte zeigen, dass eine Proteinurie bei Hunden mit SIRS häufig vorkommt. Alle gemessenen Harnparameter, d.h. Gesamtprotein, UPC, Albumin, UAC, RBP und URBPC waren im Median bei kranken Hunden am Tag 0 im Vergleich zu gesunden Tieren signifikant erhöht. 27 Hunde (69%) der kranken Gruppe hatten eine UPC >0.5, 25 Hunde (64%) hatten eine erhöhte Albuminausscheidung, nachweisbar durch einen UAC-Quotienten von >30mg/g, desweiteren war bei 36 Hunden (92%) die URBPC höher als 33.3 μg/g. Diese erhöhte RBP- Ausscheidung ohne gleichzeitig erhöhtes UPC, bzw. erhöhte Albuminwerte liess vermuten, dass bei fast allen Hunden der erkrankten Gruppe ein tubuläre Schädigung vorhanden war. Insgesamt waren die Werte für UPC und UAC am Tag 0 signifikant höher als am Tag 2, wobei diese Differenz für den Parameter URBPC nicht das Signifikanzniveau erreichte. Anhand dieser Ergebnisse ist zu vermuten, dass bei Hunden mit SIRS eine akute aber scheinbar transiente glomerulär bedingte Proteinurie auftritt, wohingegen die tubulären Schädigungen etwas länger anhalten. Die Proteinmuster im SDS- PAGE zeigten deutliche Unterschiede zwischen kranken und gesunden Hunden. Bei SIRS-Patienten trat eine deutlich höhere Anzahl von Banden auf (11 vs. 3), zusätzlich war eine größere Streuung des Molekulargewichtes zu erkennen. Bei erkrankten Hunden war am Tag 0 in 46% (n=18) der Gelelektrophoresen ein Muster für eine gemischte Proteinurie sichtbar und bei 28% (n=11) waren die Proteinmuster typisch für eine tubuläre Proteinurie. In nur 5% (n=2) der Elektrophoresen waren rein glomeruläre Proteinmuster vorhanden. Im Gegensatz dazu waren bei allen gesunden Hunden physiologische Proteinmuster zu erkennen. Obwohl eine überwiegende Anzahl der Hunde mit SIRS bei der Erstuntersuchung eine Proteinurie aufwiesen, konnte kein Unterschied in den UPC-, UAC- und URBPC-Werten der überlebenden (n=26) und nicht-überlebenden (n=13) Hunde festgestellt werden. Im Gegensatz zu Berichten aus der Humanmedizin scheint das Vorkommen bzw. der Schweregrad der Mikroalbuminurie bei Hunden mit SIRS keine Prognose im Hinblick auf die Mortalität zu erlauben. Die Frage, ob eine Abnahme der Proteinausscheidung innerhalb der ersten 48 Stunden Rückschlüsse auf einen positiven Krankheitsverlauf zulässt, konnte durch diese Studie nicht geklärt werden. Weitere Untersuchungen mit größeren Patientenzahlen wären für die Suche nach einem Marker für den Schweregrad einer systemischen inflammatorischen Reaktion und zur Beurteilung der Prognose von Hunden mit SIRS notwendig.