Kontrolle der Expression des Apoptoseregulatorgens bcl-x

Abstract

Das antiapoptotische Bcl-xL Protein nimmt eine Schlüsselfunktion in der Kontrolle der Apoptose und damit in der Pathogenese diversermaligner Erkrankungen ein. In dieser Arbeit wurde der Einfluß des 5?-nichtkodierenden Bereiches (5'-NCR) des bcl-x Gens und des5?-nichttranslatierten Bereiches (5'-NTR) der bcl-x mRNA auf die Expression des bcl-x Gens untersucht. Die Sequenzierung bisher nicht bekannter Teile des humanen bcl-x Gens und Aufklärung der bisher unbekannten vollständigenSequenz der humanen bcl-xL mRNA sowie Identifizierung und Nachweis bisher nicht bekannter mono- und bicistronischer Spleiß-und Startvarianten der bcl-x mRNA in verschiedenen humanen Zellinien ermöglichten die Identifizierung verschiedener Mechanismenzur Steuerung der Bcl-x Expression.Die Positionen der verschiedenen Transkriptionsstarts und die Lage der Sequenzdomäne mit der stärksten Promoteraktivität im5?-nichtkodierenden Bereich des bcl-x Gens unterstützen die These, daß sowohl der Transkriptionsstart als auch dieTranskriptionsaktivität durch strangabwärts vom Transkriptionsstart gelegene Promotor-elemente kontrolliert werden.Durch die funktionelle Analyse der 5?-nichttranslatierten Regeion der bcl-x mRNA konnte gezeigt werden, daß dieser Bereich eineinterne Ribosomeneintrittstelle enthält, die bcl-x mRNA also CAP-unabhängig translatiert werden kann und die Expression des bcl-xGens somit auf Ebene der Translation kontrolliert wird. Die Kontrolle der Expression eines apoptoserelevanten Gens durchIRES-vermittelte Initiation der Translation ist bisher noch nicht beschrieben worden. Die transiente Expression von antisense- und anti-antisense RNA gegen die 5?-nichttranslatierte Region verschiedener Varianten derbcl-x mRNA ermöglichte die Identifizierung der aktiv translatierten bcl-x mRNA Form. Außerdem konnte durch diese Experimenteerstmals gezeigt werden, daß die CAP-unabhängige Translation der bcl-x mRNA durch Expression von RNAs, die nurtranslationskontrollierende Sequenzen enthalten, kompetitiv gehemmt wird.Die These, daß die hier in verschiedenen humanen Zellen nachgewiesene zelluläre bcl-x antisense RNA eine katalytische Funktion beimtrans-Spleißen erfüllt, wird durch ihre geringe Konzentration, die Tatsache, daß sie keinen Einfluß auf die Transkription des bcl-x Genshat und die Existenz von zwei bicistronischen bcl-xL mRNAs gestützt.Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen auch, daß Aussagen über die Gleichgewichtskonzentration eines Proteins in einem Gewebeoder Zelltyp anhand der Gesamtkonzentration seiner mRNA Varianten nicht zulässig sind, wenn deren Translation differentiell reguliertwird.

The antiapoptotic Bcl-xL protein plays a key role in the control of apoptosis and in the pathogenesis of a variety of malignant diseases. Theinfluence of the 5'-noncoding region of the bcl-x gene and the influence of the 5'-nontranslated region of the bcl-x mRNA on theexpression of the bcl-x gene has been investigated in this work. Previously unknown parts of the human bcl-x gene were sequenced and the sequence of the hitherto unidentified complete humanbcl-xL mRNA-sequence was determined. Identification and detection of mono- and bicistronic spliceforms of the bcl-x mRNA in severalhuman cell lines and mapping of different transcription start sites in the 5'-NCR of the human bcl-x gene helped identify differentmechanisms for the control of bcl-x gene expression.The position of several transcription start- sites and the location of the major promoter activity in the 5'-noncoding region of the humanbcl-x gene support the hypothesis that the selection of certain transcription start sites and transcriptional activity are controlled bydownstream promoter elements.Functional analysis revealed that the 5'-nontranslated region of the human bcl-x mRNA contains an internal ribosome entry site (IRES)which facilitates the translation of this particular mRNA by a CAP-independent mechanism. These results lead to the conclusion that theexpression of the human bcl-x gene is significantly controlled at the level of translation. This constitutes the first example of an apoptosiscontrol gene regulated by IRES-mediated initiation of translation.Transient expression of antisense and anti-antisense RNA which correspond to the 5'-nontranslated region of different bcl-x mRNAforms enabled the identification of the preferentially translated bcl-x mRNA form. In addition, these experiments show for the first timethat CAP-independent translation of the bcl-x mRNA can be competitively inhibited by the expression of truncated RNAs containing onlythe translational control sequences.A cellular bcl-x antisense RNA that shows no influence on the bcl-x gene expression was identified and detected in several humancell-lines. The low concentration of this antisense RNA and the existence of two bicistronic bcl-xL mRNAs support the hypothesis that thecellular bcl-x antisense mRNA may have a catalytic function in trans-splicing.Finally, determining the equilibrium concentration of a protein in a certain tissue or cell type from the total concentration of its mRNAvariants is not acceptable if the mRNA variants are translated differentially.