Quantitative Veränderung der Substanz P-Expression dermaler Neurone nach Allergen-Sensibilisierung von TRPV1-knockout Mäusen

Abstract

Die neurogene Entzündung ist Bestandteil vieler inflammatorischer und allergischer Erkrankungen, so auch derer, welche die Haut betreffen. Sie wird ausgelöst durch Aktivierung sensibler Nerven und damit verbundener Ausschüttung von Neuropeptiden in verschiedene Gewebe. Substanz P, der wohl am besten untersuchte Vertreter der Neuropeptide, gehört zu ihren Hauptmediatoren. Über die Regulationsmechanismen der Substanz P-Produktion und –Freisetzung im Zuge physiologischer und pathologischer Prozesse gibt es verschiedene Hypothesen. Unter anderem wird über die Beeinflussung der Substanz P-Biosynthese durch den TRPV1, ursprünglich als Rezeptor für das in der Natur vorkommende, lipophile Alkaloid Capsaicin beschrieben, diskutiert. Ziel dieser Arbeit war es deshalb den Einfluss des TRPV1 auf die Expression von Substanz P mit Hilfe von TRPV1–knockout Mäusen zu untersuchen. Hierfür wurde das Modell der atopischen Dermatitis verwendet. Die Tiere wurden in drei Gruppen zu n = 5 eingeteilt, wobei ein Teil der Tiere (n = 10) durch intraperitoneale Injektion von Ovalbumin sensibilisiert und später durch subkutane Injektion provoziert wurde. Der andere Teil (n = 5) erhielt zur Kontrolle intraperitoneal das gleiche Substanzengemisch basierend auf dem Trägerstoff PBS, nur ohne Ovalbumin. Die Provokation erfolgte auch hier mit Ovalbumin. Untersucht wurden anschließend die Neurone der zum Dermatom gehörenden Spinalganglien Th1-Th5. Mit Hilfe von Immunhistochemie wurde an jeweils 15 – 25 Schnitten pro Ganglion die Gesamtzahl der Neurone und der Anteil der Substanz P-positiven Ganglienzellen daran ausgezählt. Weiter wurde der Anteil der aus dem Dermatom kommenden Substanz P-positiven Neurone an der Gesamtzahl der Neurone, welche das entsprechende Hautgebiet versorgen, ermittelt. Dies war möglich durch vorherige retrograde neuronale Markierung mittels des fluoreszierenden Farbstoffes Fluorogold, welcher die das Dermatom versorgenden Neurone anfärbte. Einem Teil der sensibilisierten Tiere (n = 5) wurde kein Farbstoff verabreicht, um eine beeinflussende Wirkung durch diesen auf das Ergebnis ausschließen zu können. Der Anteil der sowohl Substanz P- als auch Fluorogold-positiven Ganglienzellen an der Gesamtzahl der die Haut versorgenden Neurone war sowohl bei den sensibilisierten als auch bei den Kontrolltieren gleich, es konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (OVA: 12,28 ± 1,64 %; PBS: 10.11 ± 0,42 %; t-Test: p = 0,24). Die Behandlung der TRPV1-knockout Mäuse mit Ovalbumin führte demnach zu keiner Veränderung in der Substanz P-Biosynthese. Dies lässt eine Auslösung der normalerweise nach Sensibilisierung stattfindenden Synthesesteigerung von Substanz P durch den TRPV1 vermuten. Auf welche Art und Weise TRPV1 zur vermehrten Substanz P-Produktion führen kann, ist bisher noch nicht geklärt und bedarf weiterer Untersuchungen. Da es jedoch noch weitere die Substanz P-Freisetzung regulierende Substanzen gibt, ist offensichtlich, dass viele verschiedene Regulationswege, einer davon führt über TRPV1, einzeln oder im Zusammenspiel zu einer verstärkten oder abgeschwächten Substanz P-Wirkung führen.

Neurogenic inflammation is part of many inflammatory and atopic diseases, including those, which are affecting the skin. The inflammation is induced by activation of sensory unmyelinated neurons, which evokes the release of neuropeptides in different tissues. Substance P, the best explored neuropeptide, is one of the most important mediators of neurogenic inflammation. There exist many hypotheses about the regulation of substance P-production and –releasing during physiological and pathological processes. One of them discusses the influence of TRPV1 on the biosynthesis of substance P. TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) is known as a receptor sensitive to vanilloid molecules including native capsaicin. The intention of this work was to investigate the impact of TRPV1 on the expression of substance P. Therefore, in this study the animal model of atopic dermatitis on TRPV1-knockout mice was used. 15 animals were divided into three groups (n = 5). Two groups (n = 10) were sensitized for ovalbumin by intraperitoneal injection and were consecutively challenged by subcutan injection with ovalbumin. The third group (control group) received only a mixture without ovalbumin during sensitization and was challenged with ovalbumin as well. Afterwards, all neurons of the spinal ganglions Th1 to Th5, supplying directly the treated dermatom, have been investigated. By the help of immunhistochemistry all neurons and the fraction of substance P containing neurons out of 15-25 cuts of every ganglion have been enumerated. Additionally, all substance P-positive neurons which supply the treated dermatom have been counted and their fraction of all dermatom supplying neurons has been calculated. The identification of the neurons supplying the treated dermatom was achieved by tracing with the fluorescent dye Fluorogold. One group (n = 5) of sensitized animals was not exposed to the dye in order to exclude the influence of fluorogold on the results. The fraction of substance P- and Fluorogold-positiv neurons of all Fluorogold-positiv neurons was found to be the same for both, sensitized and non-sensitized animals. Hence, there was no significant difference (OVA: 12,28 ± 1,64 %; PBS: 10.11 ± 0,42 %; t-Test: p = 0,24). The sensitization of TRPV1-knockout mice with Ovalbumin has no influence on the substance P-biosynthesis. This confirms the assumption that TRPV1 triggers an increase of substance P-synthesis after sensitization. The mechanisms leading to this augmented substance P-production are still unknown and need further investigations. Contrarily, other regulating agents for substance P-releasing have been already investigated. Thus, only interactions of all these agents lead to an amplified or attenuated effect of substance P, respectively.