Struktur-, Dynamik- und Interaktionsstudien an Domänen des bakteriellen Photorezeptors YtvA aus Bacillus subtilis

Abstract

Bereits kurz nach der Entdeckung der Phototropine, einer Klasse von blaulicht- sensitiven Photorezeptoren, welche maßgeblich den Phototropismus von Pflanzen steuern, wurde in dem Bodenbakterium Bacillus subtils ein Protein mit einer sequenzhomologen photosensorischen Domäne identifiziert. Wie sich später herausstellte, handelte es sich bei dem nach seinem kodierenden Gen YtvA benannten Protein tatsächlich um einen blaulicht-sensitiven Photorezeptor, der viele Merkmale pflanzlicher Phototropine aufweist. Bei beiden Rezeptortypen führt das von einer N-terminalen LOV-Domäne absorbierte Licht (λmax = 450 nm) zu einer über die sogenannte Jα-Helix vermittelten Aktivierung einer C-terminalen Effektordomäne. YtvA wurde deshalb auch als das bakterielle Pendant der pflanzlichen Phototropine betrachtet. Unklar war jedoch, wie die intramolekulare Signaltransduktion von der YtvA-LOV-Domäne über die Jα-Helix auf die YtvA-STAS-Domäne im Detail realisiert ist. Eine lichtinduzierte Entfaltung der Jα-Helix, das molekulare Schaltprinzip der Phototropine, konnte für YtvA bisher weder bestätigt noch ausgeschlossen werden und, im Gegensatz zu Phototropinen, schien das von YtvA an die Zelle vermittelte Signal auf einer lichtabhängig veränderbaren Interaktion zwischen YtvA und GTP zu basieren. Die GTP-Bindestelle wurde zwar in der YtvA-STAS-Domäne vermutet, konnte bisher aber nicht eindeutig identifiziert werden. Unklar war darüber hinaus auch, in welchem Oligomerisierungszustand (Monomer/Dimer) YtvA vorliegt und wie die Domänen (LOV & STAS) und Sequenzelemente (Ncap & Jα-Helix) innerhalb des Proteins organisiert bzw. miteinander assoziiert sind. Die Beantwortung dieser Fragen war das gemeinsame Ziel zweier Forschungsarbeiten. Während sich eine Forschungsarbeit vor allem mit der Struktur bzw. den lichtinduzierten Strukturänderungen des Volllängeproteins beschäftigte und auch die möglichen Interaktionspartner von YtvA untersuchte, befasste sich diese Arbeit vorrangig mit der Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen N- und C-terminal verschieden terminierter Versionen der isolierten Sensor- und Effektordomäne. Primäres Ziel war es, Informationen über die Struktur, strukturdynamische Eigenschaften, intramolekulare Interaktionen zwischen einzelnen Sequenzelementen und die Wechselwirkung von GTP mit YtvA bzw. der isolierten STAS-Domäne zu gewinnen und so zur Aufklärung des in YtvA realisierten molekularen Schaltprinzips beizutragen. Die wichtigsten angewendeten Methoden waren die mehrdimensionale, heteronukleare Lösungs-NMR- Spektroskopie, die Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS), die Analytische Ultrazentrifugation (AUZ), die CD-Spektroskopie und die Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC). Da die Aufklärung des intramolekularen Signaltransduktionsmechanismus nur durch den Vergleich struktureller bzw. strukturdynamischer Eigenschaften der unbelichteten und der photoaktivierten Form möglich ist, wurden in dieser Arbeit darüber hinaus spezielle Belichtungssysteme entwickelt, mit denen die LOV-Domäne während NMR-, SAXS- und AUZ-Experimenten im photostationären Zustand gehalten werden konnte. Dadurch konnte eindeutig belegt werden, dass YtvA und auch die hier untersuchten Varianten der isolierten LOV-Domäne unabhängig vom Belichtungszustand fest assozierte Homodimere bilden (KD < 200 nm) und ein auf monomerem YtvA basierender Signaltransduktionsmechanismus ausgeschlossen ist. Zusätzlich konnte dadurch auch gezeigt werden, dass weder YtvA noch dessen isolierte LOV-Domäne grössere lichtinduzierte Strukturveränderungen erfahren. Ein Signaltransduktions-mechanismus, wie er für Phototropine beschrieben wurde, ist für YtvA daher zweifelsfrei auszuschließen. Durch die Aufnahme TROSY-basierter 2D 1H15N- und 3D 1H15N13C-Korrelationsspektren (HNCA, HNCACB, HN(CO)CACB, HN(CA)CO und HNCO) der uniform 2H15N13C-markierten LOV-Variante Ncap-LOV-Jα, konnten 127 von 140 möglichen 1H15N-Korrelationen des Proteins (unbelichteter Zustand) sequentiell zugeordnet werden. Basierend auf dieser Zuordnung konnte mit weiteren NMR-Experimenten (Messung residualer dipolarer 1HN15N-Kopplungen und 15N-Spinrelaxations-parameter) gezeigt werden, dass die Jα-Helix nicht mit der LOV-Domäne assoziiert ist und sich relativ unabhängig von dieser bewegen kann, wobei Letzteres jedoch nicht für den vollständigen Photorezeptor gilt. Wie sich in Sedimentationsgeschwindigkeits-experimenten herausstellte, bildet auch die isolierte STAS-Domäne Homodimere (KD ~ 400-500 µM), sodass davon auszugehen ist, dass diese auch in YtvA miteinander wechselwirken und deshalb die Dynamik der Jα-Helix im vollständigen Photorezeptor wesentlich geringer ist, als in Ncap-LOV-Jα. Durch eine sequenzpositionsspezifische Korrelationsanalyse der 1HN bzw. 15N chemischen Verschiebungen von Ncap-LOV-Jα und YtvA konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die STAS-Domänen in YtvA nicht mit den LOV-Domänen assoziert sein können. Die Funktion oder Orientierung der Ncap-Sequenz konnte nicht klar definiert werden, wie jedoch ein Vergleich der 1H15N-HSQC-Spektren von Ncap-LOV-Jα und LOV-Jα ergeben hat, scheint dieses Sequenzelement sehr wahrscheinlich mit der LOV-Domäne assoziiert zu sein. Mit Hilfe der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente konnte auch zweifelsfrei gezeigt werden, dass weder YtvA (unabhängig vom Belichtungszustand) noch die isolierte STAS-Domäne mit GTP interagiert. In dieser Arbeit wurden, soweit bekannt, auch erstmals Dissoziationskonstanten für die Wechselwirkung zwischen der LOV-Domäne und den natürlichen Flavinen Riboflavin (RF), Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenin-Dinukleotid (FAD) bestimmt. Aufgrund der starken Flavin-LOV- Interaktion wurde deflaviniertes Ncap-LOV auch erfolgreich als molekulare Sonde für die Analyse dieser Flavine in Zelllysaten von Bacillus subtilis eingesetzt und gezeigt, dass die YtvA-LOV-Domäne in vivo mit hoher Wahrscheinlichkeit zu 30% mit FMN und 70% mit RF beladen sein könnte.

Shortly after the discovery of a class of blue-light sensitive photoreceptors, the Phototropins, which control predominantly the plant phototropism, a protein with a sequence homologous photosensory domain has been also identified in the soil bacterium Bacillus subtilis. This protein has been denoted YtvA, according to its coding sequence and it turned out that it indeed is a photoreceptor, sharing many of the characteristics of phototropins. In both receptor types the absorption of blue-light (λmax = 450 nm) by the N-terminal LOV domain leads to the activation of a C-terminal effector domain in which this intramolecular signal transduction is mediated by the so called Jα-Helix. Therefore YtvA is considered to be the bacterial counterpart of plant phototropins. However, it was not clear how the light signal is transmitted from the LOV domain via the Jα-Helix to the STAS domain. A light-induced unfolding of the Jα-Helix, the molecular switching principle of plant phototropins, has yet been neither confirmed nor excluded for YtvA. Furthermore, in contrast to phototropins, a light-modulated YtvA-GTP- interaction seemed to play a crucial role in the intermolecular signal transduction process. The binding site has been suspected in the YtvA-STAS domain, but could not yet be clearly identified. It was also unclear which oligomerization state (monomer/dimer) YtvA adopts and how the domains (LOV & STAS) and sequence elements (Ncap & Jα-helix) are associated with each other and organized within the protein, respectively. Answering these questions was the common goal of two research studies. While the first research dealt mainly with the structure, the light-induced structural changes and putative interaction partners of the full-length protein, this work is mainly focused on the investigation of structure-function relationships of N-and C-terminally different truncated variants of the isolated sensor and effector domain. The primary aim was to gain information about the structure, structural dynamic properties, intramolecular interactions between the individual sequence elements and the interaction of GTP with YtvA and its isolated STAS domain and thus, to contribute to the elucidation of the molecular switching principle realized in YtvA. The predominantly used methods were multidimensional heteronuclear Solution-NMR-Spectroscopy, Small Angle X-Ray Scattering (SAXS), Analytical Ultracentrifugation (AUC), CD-Spectroscopy and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Since the elucidation of the intramolecular signal transduction mechanism is possible only through the comparison of structural and structural dynamic properties of the dark-state and the photo-activated protein. For this reason customized illumination systems have also been developed in this research work. These special light sources maintained the LOV domain in the phostationary state during NMR, SAXS and AUC experiments. In this way it could be clearly shown that YtvA and its isolated LOV domain form tight binding homodimers (KD < 200 nm) and that the dimerization is not affected by the presence of blue light. Therefore, a signal transduction mechanism based on monomeric YtvA could be clearly excluded. By means of the performed AUC and SAXS experiments no large light-induced structural changes were observed for YtvA and its isolated LOV domain, respectively. An intramolecular signal transduction mechanism as it occurs in phototropins could therfore also be excluded. 127 out of 140 possible 1H15N spin-systems of the uniformly 2H15N13C-labeled LOV variant Ncap-LOV-Jα (dark state) could be sequentially assigned using TROSY-based 2D 1H15N- and 3D 1H15N13C-correlation spectra (HNCA, HNCACB, HN(CO)CACB, HN(CA)CO and HNCO). Based upon this assignment, it could be shown by further NMR experiments (measurement of residual dipolar 1HN15N spin-couplings and 15N spin-relaxation parameters) that the Jα-helix is not associated with the LOV domain and can move relatively independently of it. However, the latter does not apply to the whole photoreceptor. As it turned out in sedimentation velocity experiments, the isolated STAS domain forms also homodimers (KD ~ 400-500 µM), thus it can be assumed that these interact in YtvA with each other too, leading to a much lower dynamic of the Jα-Helix in full-length YtvA compared to Ncap-LOV-Jα. By a sequence-position-specific correlation analysis of the 1HN and 15N chemical shifts of Ncap-LOV-Jα and YtvA was furthermore shown that the STAS domains in dimeric YtvA can not be associated with the LOV domains. The function or orientation of the Ncap sequence could not be clearly defined. As it is shown by a comparison of 1H15N-HSQC spectra of Ncap-LOV-Jα and LOV-Jα, this sequence element seems very likely to be associated with the LOV domain. With the help of experiments performed in this work it could be shown beyond doubt that neither YtvA (regardless of the presence of blue light) nor the isolated STAS domain interacts with GTP. As far as known, in this research study dissociation constants for the interaction between the LOV domain and the natural flavins riboflavin (RF), flavinmononucleotide (FMN) and flavinadenine- dinucleotide (FAD) have been determined for the first time. Due to the strong flavin-LOV-interaction flavin-free Ncap-LOV was also used successfully as a molecular probe for the analysis of these flavins in Bacillus subtilis cell lysates. This could be shown that the YtvA-LOV domain most likely contains 30% FMN and 70% RF in vivo.