Divergente Transkriptionskontrolle von HIV-1: Strukturelle und funktionale Analyse des LTR-Promotors der Gruppen M, N und O

Abstract

HIV-1 wird in drei genetisch distinkte Gruppen, M (major) N (non-M, non-O) und O (outlier) klassifiziert. Innerhalb der M-Gruppe wurden bislang 9 Subtypen und eine zunehmende Anzahl rekombinanter Viren (CRF, circulating recombinant form) identifiziert. Die Subtypen und CRF sind weltweit in Bezug auf die geographische Region und die Transmissionsgruppe sehr unterschiedlich verbreitet. Neben soziodemographischen Faktoren können die biologischen Eigenschaften des Wirtes und des Virus diese unterschiedliche Prävalenz beeinflussen. Die subtyp-spezifische Sequenzvariation des LTR-Promotors von HIV-1 (long terminal repeat) könnte zu einer divergenten Transkriptionskontrolle der Genexpression führen, die zu subtyp-spezifischen Unterschieden in der Replikationseffizienz und letztendlich in der Ausbreitungsdynamik der Subtypen führen könnte. Auch eine subtyp-spezifische Replikationseffizienz in den unterschiedlichen Zielzellen von HIV-1 wird diskutiert. Zu Beginn dieser Arbeit waren subtyp-spezifische strukturelle Unterschiede der LTR anhand eines limitierten Sets publizierter LTR-Sequenzen abzuleiten. Ausgehend von einem Isolat von Subtyp B, C und von CRF01_AE waren auch funktionale Unterschiede der LTR mit Unterschieden in der LTR-Architektur korreliert worden. Diese Ergebnisse stützten die Hypothese einer divergenten Transkriptionsregulation in Abhängigkeit vom Subtyp der LTR. In dieser Arbeit wurde erstmals die strukturelle Promotororganisation und die funktionale Aktivität des LTR-Promotors nicht nur bei verschiedenen Subtypen und CRF der Gruppe M, sondern auch im Vergleich zur Gruppe N und Gruppe O analysiert. Dazu wurde die provirale LTR von jeweils zwei Vertretern der Subtypen A bis G, von der rekominaten Form CRF01_AE und von jeweils einem Vertreter der Gruppe N und der Gruppe O in einen Luziferase-Reporter-Vektor kloniert. Pro Isolat wurden 4-10 Klone sequenziert und analysiert. In phylogenetischen Analysen wurde die ermittelte LTR-Sequenz im Vergleich zu den aktuellen Referenzsequenzen der LTR aus der HIV-Datenbank klassifiziert und eine detaillierte Strukturanalyse der vorliegenden Transkriptions-faktorbindungsstellen (cis-regulatorische Elemente) durchgeführt. Die LTR-Promotoraktivität repräsentativer Klone wurde in standardisierten transienten Transfektionsassays in der Zelllinie COS-Z-28 untersucht. Aus dem Vergleich der LTR-Promotororganisation folgt, dass es keine Strukturmerkmale gibt, in denen sich die Isolate eines Subtyps spezifisch unterscheiden. Meist wurde bei einem einzelnen Vertreter eines anderen Subtyps oder einer Gruppe ein ähnliches Bindungsmotiv identifiziert. Zum Beispiel wurde das für CRF01_AE bisher als charakteristisch beschriebene veränderte Motiv der TATAA-28-Box, ein wesentliches Element zur Bildung des basalen Transkriptionsinitiationskomplexes, auch bei dem Isolat der N-Gruppe identifiziert. Auch der NFkB-Enhancer gilt als subtyp-spezifisches Merkmal. Bislang galten drei NFkB-Bindungsmotive als charakteristisch für die LTR von Subtyp C-Viren. Es wurde jedoch ein Subtyp C Isolat identifiziert, das nur zwei NFkB-Bindungstellen aufweist, während bei einem Gruppe O-Isolat ein drittes NFkB-Motiv nach Kultivierung der Viren beobachtet wurde. Insgesamt ist der LTR-Promotor des N-Isolates der Gruppe M sehr ähnlich, der Aufbau der O-LTR unterscheidet sich dagegen deutlich von der LTR der M- und der N-Gruppe. Die Promotoren aller Gruppen wiesen eine geringe basale Transkriptionsaktivät auf und waren durch das Tat-Protein von Subtyp B transaktivierbar. Die LTR- Aktivität war bei den einzelnen Virusisolaten unterschiedlich, die Aktivitätsunterschiede waren jedoch nicht auf die Zugehörigkeit zu einer Gruppe oder zu einem Subtyp zurückzuführen. Vielmehr scheinen individuelle Strukturmerkmale der LTR für die unterschiedliche Promotoraktivität verantwortlich zu sein. LTR-Sequenzen mit drei NFkB-Enhancer-Motiven zeigen eine erhöhte basale Promotoraktivität gegenüber LTR-Sequenzen mit den für HIV-1 üblichen zwei NFkB-Enhancer-Motiven, unabhängig von der Subtyp- oder Gruppenzugehörigkeit der LTR. Isolate mit nur einer Bindungsstelle für NFkB zeigen dagegen keinen signifikanten Aktivitätsverlust. Die LTR-Aktivität ist somit nur eingeschränkt korrelierbar mit der Anzahl der NFkB-Enhancer-Motive. Die Transkriptionsaktivität der LTR von HIV-1-Isolaten der Gruppen M, N und O ist somit nicht subtyp- oder gruppen-spezifisch, sondern isolat-spezifisch reguliert. Die Ergebnisse können jedoch eine divergente Transkriptionsregulation in primären Zielzellen von HIV-1 nicht ausschließen.

HIV-1 is classified into three distinct genetic groups: M (major), N (non-M; non-O) and O (outlier). Within the group M actually nine subtypes and an increasing number of circulating recombinant forms have been identified. The global spread of subtypes and CRF (circulating recombinant form) differs with respect to geographic regions and the routes of transmission. Besides sociodemographic factors, biological properties of the host and the virus may influence the different prevalences of the subtypes. Subtype-specific sequence variation of the HIV-1 LTR promoter (long terminal repeat) could result in divergent transcriptional control of the gene expression, which in turn may lead to divergent replicative properties and may contribute to the dynamic spread of subtypes. Subtype-specific efficiency of replication depending on the HIV target cells is also discussed. When the project was initiated subtype-specific structural differences of the LTR have been derived by means of a limited set of published LTR sequences. Starting from single isolates of subtype B, C and CRFO1_AE, functional differences of the LTR were correlated with differences of the LTR architecture. These results raise the possibility that the genetic diversity of the LTR may result in HIV-1 strains with different transcriptional regulation . In this study the LTR enhancer/promoter regions of different subtypes of HIV-1 group M were characterized with regard to nucleotide sequence and promotor activity and for the first time they were analysed in comparison to group N and group O LTR promoters. The proviral LTR of the subtypes A to G, of the recombinant form CRFO1_ AE and of one group N and one group O strain was cloned into a luciferase reporter vector. Four to ten clones of each isolate were sequenced and analysed. The LTR-sequences were classified in phylogenetic analysis together with actual reference LTR sequences of the HIV database. A detailed structural analysis of cis- regulating enhancer/promoter elements was performed and the activity of representative LTR promoters was analysed in standardized transient transfection assays in COS-Z-28 cells. There are only few subtype-specific structural features which are common to all isolates of a given subtype. In most cases within a subtype or group individual LTR sequences were identified being similar to other genotypes in single binding motivs. The TATAA-28-box motiv, for example, an essential element of the basic transcription initiation complex, has a characteristic mutation in the LTR of CRF01_AE isolates, but this modification was also found in the N group. Also the structure of the NFkB enhancer is described to be subtype-specific. So far, the LTR of subtype C strains considered to carry three binding sites for NFkB. However, a subtype C isolate was identified, counting only two functional NFkB sites, whereas in the LTR of an group O isolate a third NFkB motiv appeared upon cultivation of the virus. Summarized, the organisation of the LTR enhancer/promoter of the N isolate is very similar to group M isolates, in contrast to the structure of the O-LTR which is distinct from the LTR of the M and the N group. The promoters of all virus strains had low basal transcription activity and were activated by the viral transactivator protein Tat of subtype B. The LTR activities in individual isolates were different, but there was no correlation of these differences with the phylogenetic clade to which they belonged to. Individual structural features of the LTR are not likely to be responsible for the different promoter activities. LTR sequences with three NFkB motivs showed a higher basal promoter activity in comparison to LTR sequences with two NFkB motivs, no matter which subtype or group they belong to, whereas isolates with only one binding site for NFkB had no significant loss of LTR activity. Therefore the correlation of the LTR activity and the number of NFkB motivs is restrictive. In conclusion the LTR-directed transcriptional regulation of HIV-1 isolates from group M, N and O is not specific of the subtype or group, but specific of the individual isolate. Finally, divergent transcriptional regulation in primary target cells of HIV-1 cannot be excluded.