Structural and functional analysis of immunity-associated GTPases

Abstract

GTPases of Immunity-Associated Proteins (GIMAPs) are a distinctive family of GTPases, which control apoptosis in lymphocytes and play a central role in lymphocyte maturation and lymphocyte-associated diseases. To explore their function and mechanism, we determined crystal structures of several GIMAP family members in different nucleotide-loading and oligomerization states. Nucleotide-free and GDP-bound GIMAP2 were monomeric and revealed a guanine nucleotide binding domain (G domain) of the TRAFAC (Translation Factor associated) GTPase superclass with a unique amphipathic helix alpha 7 packing against the switch II region of the G domain. In the absence of alpha 7 and presence of GTP, GIMAP2 oligomerized via two distinct interfaces in the crystal. GTP-induced stabilization of switch I mediates dimerization across the nucleotide binding site which also involves the GIMAP conserved box, which is a sequence stretch downstream of the G3 motif, and the nucleotide base. Structural rearrangements in switch II appear to induce the release of alpha 7 allowing oligomerization to proceed via a second interface. The unique architecture of the linear oligomer was confirmed by mutagenesis. Furthermore, we showed a function for the GIMAP2 oligomer at the surface of lipid droplets. The structure of the GDP-bound GIMAP5 monomer was very similar to GDP-bound GIMAP2, suggesting the conservation of the fold within the GIMAPs. The protein was shown to partially co-localize with the lysosomal compartment in a T cell line. In the crystal structure of GMPPNP-bound GIMAP7, a dimeric arrangement of the protein was observed. The dimer interface proved to be identical to one of the GIMAP2 oligomerization interfaces. We termed this binding interface G-interface, since it involves the guanine-nucleotide binding site and the bound nucleotide. Using site-directed mutagenesis, we identified a conserved arginine residue within the G-interface, which stimulates the GTPase reaction in the opposing protomer within the GIMAP7 dimer. In GIMAP2, the corresponding arginine plays a structural role in the dimerization process and is not involved in catalysis, since GIMAP2 does not show any GTP-hydrolytic activity. While earlier studies indicated that GIMAPs are related to the septins, the current structure also revealed a strikingly similar nucleotide coordination and dimerization mode as in the dynamin GTPase. Based on this, we re-examined the relationships of the septin- and dynamin-like GTPases and demonstrate that these are likely to have emerged from a common membrane-associated dimerizing ancestor. This ancestral property appears to be critical for the role of GIMAPs as nucleotide-regulated scaffolds on intracellular membranes.

GTPasen der immun-assoziierten Proteine (GIMAPs) sind eine spezielle GTPase- Familie, die Apoptosevorgänge in Lymphozyten kontrollieren und eine zentrale Rolle in der Lymphozytenentwicklung und in Lymphozyten-Erkrankungen spielen. Um ihre Funktion und ihre Mechanismen zu verstehen, wurden mehrere GIMAP- Kristallstrukturen gelöst, in verschiedenen Nukleotidbeladungs- und Oligomerisierungsstadien. Nukleotidfreies, monomeres GIMAP2 besteht aus einer Guaninnukleotidbindedomäne (G-Domäne) der translationsfaktor-assoziierten (TRAFAC) Klasse und einer amphipatischen Helix alpha 7, die gegen die switch II Region der G-Domäne faltet. Ohne diese Helix alpha 7 und in GTP-gebundenem Zustand oligomerisiert GIMAP2 über zwei verschiedende Kontaktflächen. GTP- induzierte Stabilisierung der switch I Region ermöglicht die GTP-spezifische Dimerisierung über die GTP-Bindestelle, wobei auch die GIMAP-spezifische konservierte Box beteiligt ist, ein Sequenzabschnitt direkt nach dem G3-Motiv. Die Nukleotidbase selbst spielt auch eine Rolle in der Dimerisierung. GTP- induzierte Strukturänderungen in der switch II Region könnten zur Ablösung von alpha 7 führen und eine weitere Oligomerisierung über eine zweite Kontaktfläche hervorrufen. Die Architektur des Oligomers wurde durch Mutagenese einzelner Aminosäuren und weiterfürende Studien bestätigt. Weiterhin konnten wir in einer T-Zellline die Lokalisierung von GIMAP2 an der Hülle von intrazellulären Lipidtröpfchen zeigen. Die Struktur des GDP- gebundenen, monomeren GIMAP5-Proteins erwies sich der Struktur des GDP- gebundenen GIMAP2 als sehr ähnlich, daher könnte die festgestellte Faltung stellvertretend für die ganze Proteinfamilie gelten. In einer T-Zelllinie wurde eine teilweise Kolokalisierung des Proteins mit Lysosomen festgestellt. In der Kristallstruktur von GMP-PNP-gebundenem GIMAP7 lag das Protein als Dimer vor. Die Dimer-Kontaktfläche ist äquivalent zu der, die in GTP- gebundenem GIMAP2 beobachtet wurde. Durch Mutagenesestudien konnte ein konservierter Arginin-Aminosäurerest identifiziert werden, der die GTP Hydrolyse im gegenüberliegenden Protomer des GIMAP7 Dimers stimuliert. Der entsprechende Argininrest im GTP-abhängigen GIMAP2 Dimer ist hingegen nur ein struktureller Rest, der an der Dimerisierung beteiligt ist. GIMAP2 besitzt auch keinerlei GTP-Hydrolyseaktivität. Frühere Studien zeigten, dass die GIMAP-Familie mit den Septin-Proteinen verwandt ist. Der GTP-abhängige Dimer, der in dieser Arbeit gefunden wurde, zeigt jedoch einen Dimerisierungsmodus, der auch im Dynamin G-Domänendimer vorliegt, dessen Struktur kürzlich ermittelt wurde. Unter diesem Gesichtspunkt wurden die phylogenetischen Beziehungen zwischen Septin- und Dynamin-ähnlichen GTPasen erneut untersucht, und es wurde gezeigt, dass diese einen gemeinsamen dimeren membran- assoziierten Vorfahren besitzen. Diese Ureigenschaft scheint auch wichtig zu sein für die Funktion von GIMAPs als nukleotid-gesteuerte Gerüstproteine an intrazellulären Membranen.