Untersuchungen zur Identifizierung und Charakterisierung der EF-Tu Kinase

Abstract

Der Elongationsfaktor Tu (EF-Tu), welcher zur Superfamilie der GTPasen gehört, ist das am häufigsten in Prokaryonten vorkommende Protein. Seine genaue Funktion liegt in der Beladung der A-Stelle des aktiven Ribosoms mit der korrekten Aminoacyl-tRNA. Dabei interagiert EF-Tu mit verschiedenen Komponenten der Proteinbiosynthese und liegt in zwei unterschiedlichen Konformationen vor. Eine besonders interessante Eigenschaft von EF-Tu ist dessen reversible Phosphorylierung während des Elongationszyklusses. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in mehreren verschiedenen Ansätzen versucht, das für die Phosphorylierung von EF-Tu verantwortliche Enzym – die EF-Tu Kinase – zu identifizieren und genauer zu charakterisieren. Ein erster Versuch, die EF-Tu Kinase mit Hilfe eines Yeast Two Hybrid Assays gegen eine genomische E. coli Bibliothek zu „fangen“, erwies sich als nicht erfolgreich. Dabei wurde festgestellt, daß diese Methode hierfür ungeeignet ist. Als nächstes Experiment wurde eine Affinitätschromatographie gegen ein Substratpeptid der EF-Tu Kinase durchgeführt. Von den derart aufgereinigten Proteinen konnten mehrere ribosomale Proteine, die an der A-Stelle des Ribosoms positioniert sind, sowie diverse Chaperone bzw. Hitzeschockproteine als potentielle Bindungspartner von EF-Tu identifiziert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden verschiedene Phosphorylierungsassays durchgeführt, um die EF-Tu Kinase genauer zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Versuche konnte eine Beteiligung von Chaperonen an der Phosphorylierung von EF-Tu nahezu ausgeschlossen werden. Statt dessen stellte sich heraus, daß die EF-Tu Kinase entweder ein Bestandteil des Ribosoms oder zumindest sehr fest am Ribosom gebunden ist. In einem weiteren Experiment sollte der Einfluß verschiedener an der Proteinbiosynthese beteiligter Proteine auf die Phosphorylierung von EF-Tu untersucht werden. Hierfür wurden das ribosomale Protein S1, der Elongationsfaktor P (EF-P) sowie die ribosomale ATPase RbbA überexprimiert, aufgereinigt und anschließend zu einem Phosphorylierungsassay gegeben. Allerdings konnte bei keinem dieser Proteine ein Einfluß auf die Phosphorylierung von EF-Tu festgestellt werden. Dafür wurde zum ersten Mal die in vitro Phosphorylierung von EF-P unabhängig von einer Phageninfektion nachgewiesen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse stimmen größtenteils mit dem von Corinna Lippmann postulierten Modell zur Phosphorylierung von EF-Tu im Elongationszyklus überein. Jedoch wird darin noch von einer löslichen, nur locker am Ribosom assoziierten EF-Tu Kinase ausgegangen. Abschließend wurde in diesem Zusammenhang ein leicht modifiziertes Modell mit einer im Ribosom integrierten EF-Tu Kinase aufgestellt.

The elongation factor Tu (EF-Tu) belonging to the superfamily of GTPases is the most abundant protein in prokaryotic cells. In protein biosynthesis EF-Tu is responsible for delivering the correct aminoacyl-tRNA to the A site of the active ribosome. Thereby it interacts with several components of the translation apparatus and exists in two different conformations. Most interestingly EF-Tu gets reversibly phosphorylated during the elongation cycle. In this work several different approaches were made to identify and to characterize the EF-Tu kinase, the enzyme responsible for the phosphorylation of EF-Tu. A first attempt to identify the EF-Tu kinase using a yeast two- hybrid system against a genomic library from E. coli wasn’t successful. Thereby it became apparent that the yeast two hybrid system is unsuitable for this intention. In a second experiment, an affinity chromatography against a substrate peptide of the EF-Tu kinase was carried out. Among the purified proteins a couple of ribosomal proteins all positionned at the A site of the ribosome and some chaperones respectively heat shock proteins could be identified as potential binding partners of EF-Tu. Based on these results several phosphorylation assays were done to further characterize the EF-Tu kinase. According to the findings of these experiments a contribution of chaperones to the phosphorylation of EF-Tu could be considered as very unlikely. Instead, it could be demonstrated that the EF-Tu kinase is either a part of the ribosome or at least very tightly bound to the ribosome. In another experiment, the influence of several proteins involved in protein biosynthesis on the phosphorylation of EF-Tu was examined. Therefore the ribosomal protein S1, the elongation factor P (EF-P) and the ribosomal ATPase RbbA were overexpressed, purified and then added to a phosphorylation assay. In this case, none of the proteins showed an effect on the phosphorylation of EF-Tu. Apart from that, the in vitro phosphorylation of EF-P independent of phage infection could be observed for the first time. For the most part, the insights obtained in this work correspond with the model of the phosphorylation of EF-Tu within the elongation cycle postulated by Corinna Lippmann. However, herein it was assumed that the EF-Tu kinase is soluble, only loosely bound to the ribosome. Concluding, a slightly modified model with the EF-Tu kinase integrated into the ribosome was set up.