Untersuchung der antigenen Proteinfraktionen eines Sarcoptes-Milben-Extraktes durch SDS-PAGE, Immunoblot, Zweidimensionale Gelelektrophorese und Sequenzanalyse

Abstract

Mit der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welche Fraktionen des komplexen Proteingemisches des Sarcoptes-Milbenextraktes die spezifischen Sarcoptes-Antikörper zu binden vermögen, also antigen wirksam sind. Voraussetzung für die Untersuchungen war eine qualitativ und quantitativ hinreichende Antigenpräparation in Form eines Milbenextraktes. Für seine Herstellung wurden Sarcoptes-Milben von natürlich infizierten, toten Rotfüchsen durch Entnahme von Geschabseln gewonnen. Durch ein sich anschließendes Auswanderungsverfahren wurden die Milben isoliert und verarbeitet. Das so entstandene komplexe Proteingemisch wird auch als Rohantigen bezeichnet, da es durch Homogenisierung des gesamten Milbenkörpers hergestellt wurde. Durch die eindimensionale SDS-PAGE wurde das Proteingemisch gemäß der unterschiedlichen Molekulargewichte in 33 Banden im Bereich zwischen 15-225 kDa aufgetrennt. Von diesen Proteinbanden wurden 18 durch spezifische Antikörper im Immunoblot erkannt und gebunden. Durch die 2-D Gelelektrophorese erfolgte die Auftrennung sowohl aufgrund der unterschiedlichen isoelektrischen Punkte, als auch aufgrund der unterschiedlichen Molekulargewichte. So ließen sich die spezifischen Antikörper-bindenden Proteinbanden aus der eindimensionalen Elektrophorese detaillierter darstellen. Zusätzlich wurde durch Anwendung dieser Methode eine größtmögliche biochemische Reinheit der Protein-Spots erreicht, die die nachfolgende Sequenzierung ermöglichte. Vor der Durchführung der Sequenzanalyse wurden die Protein-Spots auf eine PVDF-Membran geblottet und nach dem Blot mittels Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. Die Sequenzierung erbrachte von insgesamt 8 Spots bei zweien ein Ergebnis. Bei Spot 11 wurde folgende Sequenz ermittelt: (Ala/Ser) Pro Asn His Asp Lys Ala Phe Asp (Val/Glu) Leu ý Val, bei Spot 12: (Met/Gln) (Lys/Ser/Gly) Asn (Lys/Ser) Ala Val Leu Leu Gly Val Tyr Glu Asn ý Asp.

This research project was aimed to establish wich fractions of the complex protein solution of the Sarcoptes mite extract would be able to bind specific Sarcoptes antibodies and would thus be effective in an antigenic fashion. For the succes of this experimental study a qualitatively and quantitatively suficient antigen preparation of mite extract solution was indispensible. To achieve this objective, an extract of Sarcoptes scabiei var. vulpes was prepared by harvesting mites collected from crusts of carcasses of naturally infested red foxes. The mites were subsequently isolated by a migration technique and then processed. The protein mixture was produced through homogenization of the entire mitebody also defined as "raw antigen". By applying the one dimensional SDS-PAGE the proten mixture could be separated into 33 bands in the range of 15-225 kDa. 18 of these protein bands were classified and bound by specific Sarcoptes antibodies in the immunoblot. By using the technique of Two-dimensional electrophoresis, the proteins were arranged according to their distinct isoelectric points as well as their variable molecular weights. Thus it was possible to present the specific antibody binding protein bands in greater detail. Additionally, by applying this method the greatest biochemical purity of the protein spots could be achieved. This made the posterior sequenz of operation feasible. Before undertaking the sequenz analysis the protein spots were blotted on a PVDF membrane and differentiated by Coomassie coloration. In the applied sequencing process 2 out of 8 spots yielded results. The spots showed the following sequences: Spot 11: (Als/Ser) Pro Asn His Asp Lys Ala Phe Asp (Val/Glu) Leu - Val Spot 12: (Met/Gln) (Lys/Ser/Gly) Asn (Lys/Ser) Ala Val Leu Leu Gly Val Tyr Glu Asn - Asp