Die Rolle des COP9 Signalosoms bei der hyperthermen intraperitonealen Chemotherapie: Mögliche Konsequenzen für die Klinik

Abstract

Peritonealkarzinose galt lange Zeit als palliative Situation. Die Entwicklung eines lokalen Behandlungskonzepts, zytoreduktive Chirurgie in Kombination mit hyperthermer intraperitonealer Chemotherapie (HIPEC), ermöglicht heutzutage eine kurative Therapie. Die häufig verwendeten Chemotherapeutika Mitomycin C (MMC) und Cisplatin (CDDP) führen über ihre alkylierende Wirkung zu Doppelstrangbrüchen. Die DNA-Defekte induzieren Reparaturmechanismen, an denen das COP9 Signalosom (CSN) beteiligt ist. Das CSN ist ein Proteinkomplex, bestehend aus 8 Untereinheiten. Es ist ein Regulator des Ubiquitin-Proteasom- Systems (UPS) und kontrolliert die Stabilität von Proteinen, die an der DNA- Reparatur beteiligt sind. Außerdem ist es bei der Zellzykluskontrolle involviert und bestimmt die Aktivität von Tumorsuppressorproteinen wie p53. Die koordinierte Expression des CSN wird durch miRNAs der let-7-Familie reguliert. miRNA let-7a-1 bindet an die mRNA der CSN-Untereinheiten und agiert als negativer Regulator der CSN-Expression. Um die Rolle des CSN bei der HIPEC zu entschlüsseln, wurden HT29-Kolontumorzellen entsprechend den Bedingungen der HIPEC für 1 h und 4 h mit unterschiedlichen Konzentrationen MMC und CDDP, erwärmt in Medium auf 42°C, behandelt. Mittels Western Blot wurde das CSN und die mit dem CSN-interagierenden Proteine analysiert, wobei sich ein Anstieg der CSN-Untereinheiten unter MMC-Inkubation als Hinweis auf DNA-Reparatur zeigte. Dieser Prozess konnte durch Transfektion der HT29-Zellen mit miRNA Mimics der let-7-Familie verhindert werden und eine verstärkte Expression des Zellzyklusregulators p27 und des Tumorsuppressorproteins p53 wurde beobachtet. Außerdem wurde die Apoptoserate nach HIPEC mittels Caspase-3-Elisa quantifiziert, wobei sich nach 4 h MMC-Inkubation ein signifikanter Anstieg der aktivierten Caspase-3 zeigte. Nach 1 h MMC-Behandlung wurde nur unter sehr hoher MMC-Konzentration ein Anstieg der aktivierten Caspase-3 nachgewiesen. Um die Apoptoserate zu steigern, wurde Curcumin, ein Hemmstoff CSN-assoziierter Kinasen mit anti-proliferativen und anti-karzinogenen Eigenschaften getestet. Durch die Kombination von Curcumin mit MMC konnte eine signifikante Verbesserung der Apoptoserate erzielt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das CSN eine restriktive Rolle bei der HIPEC spielt, da es die Tumorzellen bei der DNA-Reparatur unterstützt und die Apoptose verzögert. Um die CSN-Aktivität zu blockieren und die Effizienz der HIPEC zu verbessern, kommen zwei Mechanismen in Betracht: Erstens die Anwendung von Curcumin bei der HIPEC. Curcumin blockiert CSN-assoziierte Kinasen und steigert den MMC- Effekt. Mit dem Einsatz von Curcumin könnte die MMC-Konzentration reduziert werden, mit der Konsequenz geringerer toxischer Nebenwirkungen für Patienten. Zweitens wäre die Zugabe von miRNA-let-7a-1 Mimic zur Chemoperfusionslösung denkbar. miRNA let-7a-1 Mimics verhindern die CNS-Expression und begünstigen pro-apoptotische Bedingungen. Weitere Studien sind notwendig, um die hier gewonnenen Erkenntnisse unter klinischen Bedingungen anzuwenden.

Peritonealcarcinomatosis has long been considered as a palliative situation. Local treatment strategies have been developed combining cytoreductive surgery and hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) offering a curative therapy. The frequently used chemotherapeutic agent Mitomycin C (MMC) and Cisplatin (CDDP) generating double-strand breaks with their alkylating properties. The DNA damage induces repair mechanisms including the COP9 signalosome (CSN). The CSN is a protein complex composed of 8 subunits (CSN1-CSN8). It is a regulator of the ubiquitin proteasome system (UPS) and controls protein stability of DNA damage repair effectors. Furthermore it is involved in cell cycle regulation and determines the activity of tumor suppressor proteins such as p53. The coordinated expression of CSN subunits is modulated by miRNAs of the let-7 family. miRNA let-7a-1 binds to the mRNA of CSN subunits and acts as a negative regulator of their expression. To investigate the role of the CSN during HIPEC, colon cancer HT29 cells were incubated under HIPEC-conditions for 1 h or 4 h with different concentrations of MMC and CDDP in medium heated to 42oC. By Western blotting the CSN and its interacting proteins were analysed. Increased CSN subunit expression has been detected, possibly as an indication for DNA-damage repair. Transfection of the HT29-cells with miRNA let-7a-1 mimic prevents this process and an overexpression of cellcycle regulator p27 and of tumor suppressor protein p53 has been monitored. Moreover apoptosis after HIPEC has been detected with Caspase-3-ELISA. Significant increase of activated Caspase-3 was measured after 4 h MMC-incubation. After 1 h MMC-treatment increase of activated Caspase-3 has been detected only under high MMC-concentration. To improve apoptosis Curcumin, an inhibitor of CSN-assoiated kinases with anti- proliferative and anti-carcinogenic qualities has been tested. The combination of Curcumin with MMC achieved a significant improvement of apoptosis. In summary the CSN plays a restrictive role during HIPEC because it supports the tumor cells during DNA-repair and delayed apoptosis. For blocking CSN- activities and improving the efficiency of HIPEC two mechanisms are possible: First, the application of Curcumin during HIPEC. Curcumin blocks CSN- assiociated kinases and enhances the MMC-effect. With Curcumin the MMC- concentration could be reduced with the consequence of less toxic side effects for the patients. Secondly, addition of miRNA mimic to the chemoperfusion media would be a plausible strategy. miRNA let-7a-1 mimic impairs the CSN- expression and promotes pro-apoptotic conditions. Further studies are necessary to apply these findings under clinical conditions.