Untersuchungen zum nichtviralen Gentransfer in die Lunge im Mausmodell - Einfluss der Applikationsart, molekularbiologischer Faktoren und magnetischer Drug Targetingmechanismen

Abstract

Eine mögliche Strategie des Gentransfers in die Lunge ist die Verwendung von PEI-pDNA Komplexen, die als Aerosol oder via intranasaler Instillation appliziert werden können. In dieser Arbeit wurden mehrere Ansätze verfolgt, um den nichtviralen Gentransfer in Lungengewebe zu verbessern und die Kinetik der Genexpression sowie die Auswirkung auf die Lungenfunktion zu bestimmen. Nach intranasaler Instillation von PEI-pDNA Komplexen in Mäuse war die pDNA- Clearance aus dem Lungengewebe um das 3,5-fache höher als nach Aerosolapplikation. Eine Luziferaseexpression als Zeichen eines erfolgreichen Gentransfers konnte nach intranasaler Instillation nur kurzfristig 24 h nach der Behandlung detektiert werden. Nach Aerosolapplikation war die Luziferaseexpression nach 72 h am höchsten und blieb bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt (7 Tage) konstant. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der geringeren Clearance nach Aerosolapplikation. Die Luziferaseexpression konnte nach Aerosolapplikation von CpG-freier pDNA weiter gesteigert werden. Bezüglich der Lungenfunktion fand sich sowohl nach Aerosolapplikation als auch nach intranasaler Instillation von PEI-pDNA z.B. eine erniedrigte Compliance der Lunge, was möglicherweise auf eine durch die Behandlung ausgelöste Entzündungsreaktion zurückzuführen ist. Diese zeigte sich auch in histologischen Untersuchungen der Mauslungen. Wurde statt der CpG-haltigen pDNA CpG-freie pDNA vernebelt, war die Lungenfunktion weniger eingeschränkt und es zeigte sich keine Veränderung der Lungenhistologie. In dieser Arbeit wurde außerdem untersucht, ob die pDNA mittels magnetischer Ablenkung gezielt an den Ort einer möglichen Erkrankung in der Lunge gelenkt werden kann. Dazu wurden PEI-pDNA Komplexe zusammen mit SPION formuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die magnetische Ablenkung von SPION in der Mauslunge funktioniert und zu einer gezielten, erhöhten Deposition von pDNA führt. Die Lungenfunktion wird durch die Verwendung von SPION dabei nicht zusätzlich eingeschränkt. Eine neue Methode zur Steigerung der Gentransfereffizienz wurde etabliert, die auf der Verwendung des Glucocorticoidrezeptors (GR) als Transkriptionsfaktor beruht. Wird GR durch Dexamethason aktiviert, führt dies zu einem Transport des GR aus dem Zytoplasma in den Zellkern einer Zelle. Wird vorher pDNA, die Glucocorticoidrezeptor-responsive Elemente enthält (GRE), an GR gebunden, kann der Transfer von pDNA aus dem Zytoplasma in den Zellkern verbessert werden. In in vivo Versuchen, in denen PEI-pDNA mittels Aerosol im Mausmodel appliziert wurde, konnte eine verbesserte Genexpression (4,7-fach) nach Gabe von pEGFPLucGRE2 im Vergleich zu pEGFPLuc nachgewiesen werden, wenn 2 h nach der Aerosolapplikation Dexamethason intraperitoneal appliziert wurde. Eine Herausforderung in der Zukunft wird sein, die Methode der Aerosolapplikation von Gentransferkomplexen auf ein Großtiermodel und letztendlich auf Patienten zu übertragen und zu optimieren. Insbesondere sollte dabei CpG-freie DNA verwendet werden, da sich dadurch die Verträglichkeit und die Gentransfereffizienz verbessern lassen.

One strategy of gene transfer to the lung is to use PEI-pDNA complexes, which can be applied via aerosol or intranasal instillation. In this work different strategies were followed to enhance nonviral gene transfer into mice lungs and to improve the kinetic of gene expression. Additionally, the influence of gene transfer on lung function of mice was determined. The pDNA-clearance out of lungs was 3.5-times higher after intranasal instillation of PEI-pDNA complexes to mice compared to the clearance after aerosol application. Luciferase expression as a sign for effective gene transfer was observed only 24 h after intranasal instillation. After aerosol application, the highest expression rate was detected after 72 h and remained at high levels up to day seven. This result is consistent with the lower clearance rate after aerosol application. Luciferase expression could be further enhanced in experiments, which used CpG-depleted pDNA for aerosol gene delivery. Concerning lung function parameters, compliance of lungs was reduced after intranasal instillation as well as after aerosol application. This may be due to an inflammatory effect caused by the treatment with PEI-pDNA complexes. This was also observed in histological examinations and may be caused by CpG motives in the pDNA used for the treatment. After aerosol application of CpG-depleted PEI-pDNA complexes, lung function of mice was less impaired and histology of mice lungs was not changed compared to untreated control mice. Hence, the usage of CpG- depleted pDNA also resulted in improved lung function parameters, beside increased gene expression levels. To further improve gene delivery into the lung the targeted aerosol delivery to the lung with aerosol droplets comprising superparamagnetic iron oxid nanoparticles (SPION) – so called nanomagnetosols – in combination with a target directed magnetic gradient field was examined. PEI-pDNA complexes were formulated together with SPION. It was shown, that magnetic deflection of SPION in mice lungs was possible and a targeted and increased deposition of pDNA was achieved. Lung function was not deteriorated additionally by the usage of SPION. Furthermore, in this work a new method to increase gene transfer efficiency was established, which is based on the usage of the glucocorticoid receptor (GR) as transcription factor. After activation of GR by dexamethasone, GR is transported from the cytoplasm into the nucleus of a cell. pDNA containing a glucocorticoid responsive element (GRE) can bind to GR in the cytoplasm. Therefore, binding of the GR to its GRE and activation by its ligand (dexamethasone) can be used for the active transport of pDNA from the cytoplasm into the nucleus. In in vivo experiments PEI-pDNA complexes were applied to mice via aerosol. After application of pEGFPLucGRE2 gene expression increased about 4.7-times compared to pEGFPLuc, if dexamethasone was injected intraperitoneally 2 h after aerosol application. One challenge in the future will be to transfer the method of aerosol application of gene transfer complexes to a big animal model and finally to patients and to optimize these methods. In particular, CpG-depleted pDNA should be used because tolerance and gene transfer efficiency are increased.