Analyse der Bedeutung der alpha-Mannosidase I und RHAMM für die T-Zellaktivierung

Abstract

alpha-Mannosidase I Die alpha-Mannosidase I ist ein Schlüsselenzym bei der Biosynthese von N-Glycanen und wurde in Transplantat-infiltierenden Leukozyten als differentiell reguliertes Gen identifiziert (Toleranz). Die Aktivität kann mit dem Inhibitor Kifunensine spezifisch unterbunden werden und verursacht eine grundlegende Veränderung in der Struktur der N-Glycane von komplexen zu Mannose-reichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Transkription der alpha- Mannosidase I während der T-Zellaktivierung transient reduziert wird. Die Inhibition der alpha-Mannosidase-I-Aktivität führt zu einer höheren Frequenz an CD69+-T-Zellen, gesteigerten IL-2-Produktion und -Transkription. Ebenso wurde eine erhöhte IFN-gamma-Transkription und Proliferation festgestellt. Hierdurch wird die These der einfacheren Bildung der immunologischen Synapse und vereinfachten T-Zellaktivierung gestützt. Erste Untersuchungen an T-Zellen mit erhöhter alpha-Mannosidase-I Expression zeigten, dass die vermehrte N-Glycosylierung der Oberflächenproteine die Aktivierung von T-Zellen negativ beeinflusst und in einer geringeren Ausschüttung von IFN-gamma mündet. Zudem konnte gezeigt werden, dass die genannten Effekte hauptsächlich über die Beeinflussung von naiven T-Zellen realisiert werden. Memory T-Zellen zeigten sich in ihrer Aktivierung unabhängig von der alpha-Mannosidase-I-Aktivität. Rezeptor für Hyaluronan-vermittelte Migration (RHAMM) Der Rezeptor für Hyaluronan-vermittelte Migration wurde in Transplantat-infiltierenden Leukozyten als differentiell reguliertes Gen identifiziert (Abstoßung). Es konnte gezeigt werden, dass die Transkription von Rhamm während der T-Zellaktivierung erhöht wird. Erste in vitro und in vivo Untersuchungen zeigten, dass Rhamm sowohl die Aktivierung als auch die Migration von T-Zellen beeinflusst. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass im murinen System mehr als drei Isoformen von Rhamm transkribiert werden, deren transkriptionelle Regulation und Rolle während der T-Zellaktivierung noch unklar ist. Mit Hilfe der siRNA-Technologie war es möglich, die Transkription von Rhamm weitestgehend zu unterbinden, wodurch die Möglichkeit besteht, die Rolle von Rhamm bei der T-Zellaktivierung detailliert zu untersuchen.

alpha-Mannosidase I N-linked protein glycosylation represents an important cellular process for modifying protein properties. It resembles a cascade of various enzymatic reactions, in which class I alpha−mannosidases play a central role. It is well established that N-glycosylation plays a major role for immune functions. Interestingly, Sawitzki and colleagues identified alpha- mannosidase I as being highly expressed in graft infiltrating cells of tolerance developing recipients. I now studied the expression and function of alpha-mannosidase I in total CD4+, naïve and memory T cells by analysing alpha-mannosidase I transcription and activity. Alpha-mannosidase I function was altered by i) treatment with Kifunensine, a specific inhibitor for class I alpha-mannosidases, ii) downregulation of alpha-mannosidase I gene expression using siRNA transfection, and iii) overexpression utilising retroviral gene transfer. T cell activation was evaluated studying CD69 expression, IL-2 and IFN-gamma production. My results demonstrate that alpha-mannosidase I transcription is transiently down-regulated following T cell activation, and that alpha-mannosidase I exerts an inhibitory effect on T cell activation. Most interestingly, these effects were restricted to naïve CD4+ T cells, while memory cells remained nearly unaffected. Thus complex N-glycans generated by enzymes such as alpha-mannosidase I inhibit the activation of naïve T cells. These findings could be used to improve the ex vivo priming of naïve T cells for adaptive T cell therapies. Receptor for hyaluronan-mediated motility (RHAMM) Sawitzki and colleagues identified the receptor for hyaluronan- mediated motility (RHAMM) as being highly expressed in transplantat infiltrating leucocytes of acutely rejecting recipients. I now studied the expression and function of RHAMM during T cell activation in vitro and in vivo. My results demonstrate that RHAMM transcription is highly up-regulated during T cell activation. Furthermore, inhibition of RHAMM expression utilising siRNA transfer resulted in decreased IFN-gamma expression by T cells as well as diminished their migratory potential and effector capacity in a model of transfer colitis. The results also show that in the murine system more than three RHAMM isoforms are transcribed. However, their transcriptional regulation and role during T cell activation are still unknown. Using siRNA technology transcription of RHAMM can be suppressed, providing a possibility for a more detailed examination of its role during T cell activation.