Struktur-Wirkungs-Studien an estrogen wirksamen Verbindungen mit 1,2 -Diarylethan-Strukturelement: Untersuchungen von Typ-I- und Typ-II-Estrogenen an ERα und ERβ

Abstract

Estrogene vermitteln ihre Wirkung über den Estrogenrezeptor (ER), einen li­gan­den­in­du­zier­ten Transkrip­tionsfaktor. Seit 1996 ist bekannt, dass es zwei Re­zep­tor­sub­typen (ERα und ERβ) mit un­ter­schied­lichem Verteilungsmuster im mensch­lichen Orga­nis­mus und gegenseitiger Beeinflussung gibt. Sie regulieren neben der weiblichen Re­pro­duk­tions­endo­kri­no­logie Zell­pro­li­fe­ra­tion und -dif­fe­ren­zie­rung in vielen weiteren Gewe­ben, auch beim Mann. Physio­lo­gi­scher Ligand beider ER-Subtypen ist Estra­diol (E2). Neben diesem sind weitere steroidale und eine Reihe nicht steroi­da­ler Ver­bin­dungen mit agonistischer und antagonistischer Wirkung auf ERα und ERβ bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zur Ergänzung des Testystems mit ERa-ab­hän­gi­gen MCF-7 -2a-Zel­len ER-sub­typ­se­lek­tive Transaktivierungsassays auf Basis tran­sien­ter Transfektion genuin ER-nega­tiver U-2OS-Zellen aufgebaut. Die Testsysteme mit U-2OS-Zellen reagierten sowohl auf Agonisten als auch Anta­go­nis­ten empfind­licher als MCF-7-2a-Zellen. Verantwortlich dafür wurden estrogen­affine Strukturen ohne Transkrip­tions­aktivität im Bereich der Zellmembran der MCF‑7-2a-Zel­len gemacht (mem­bran­stän­di­ger ER). Verschiedene Verbindungen mit dem von Hexestrol abgeleiteten 1,2-Di­aryl ­ethan-Struk­tur­ele­ment wurden auf ihre Wir­kung am ER untersucht. Als wichtiges Merk­mal stellte sich eine para-Hydroxy­grup­pe in beiden Arylresten heraus. Nur Ver­bin­dun­gen mit zusätzlichen hydrophoben Struk­tur­kom­po­nen­ten wie Azid­grup­pen oder Di­iodo­platin­ein­heiten zeigten trotz para-Methoxy­grup­pen estro­gene Ak­ti­vi­tät. Eine (R,S)/(S,R)-Konfiguration des 1,2-Diarylethan-Strukturelements erwies sich bei allen Subst­anz­klas­sen als über­le­gen gegenüber den diastereomeren Ver­bin­dun­gen. Auf Grund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu E2 wurden offenkettige 1,2-Diazido- und 1,2-Di­ami­no-1,2-di­aryl­ethane als Typ-I-Estrogene klassifiziert. Ihr Bin­dungs­modell geht von einer zu E2-ana­lo­gen Asso­zia­tion im ER aus. (1R,2S)/(1S,2R)-1,2-Diamino-1-(2,6-dichlor-4-hydroxyphenyl)-2-(2-chlor-4-hy­droxy­phenyl)ethan (21 a) war an ERα ca. 10‑mal wirksamer als an ERβ (EC50: ERα = 2.8 nM; ERβ = 31 nM). Sterische Be­hin­de­rungen zwischen einer Amino­gruppe und der Seitenkette von Met336 in ERβ könnten hierfür ver­ant­wort­lich sein. In Abhängigkeit ihren Grundstruktur zeigten (R,S)/(S,R)-konfigurierte zyklische Typ‑II-Estro­gene unter­schied­liche estro­gene Wirkungen. Neben dem Prototyp dieser Klasse, den [1,2-Diamino-1,2-di­aryl­ethan]­Pt(II)-Komplexen, zeigten 4,5-Di­aryl-2-imidazoline eine gute estrogene Wirk­sam­keit. Diese konnte bei 4,5-Di­aryl-2-imidazolinen durch Stei­ge­rung der Lipo­philie über Er­hö­hung des Chlo­rie­rungs­grades in den Aryl­reste, N‑Alky­lierung und teilweise durch N,N -Di­al­ky­lie­rung ver­stärkt werden. Eine Alky­lie­rung von C‑2 führte hingegen zu einer Ab­nahme der estro­ge­nen Wirk­sam­keit. Als wirksamste Verbindung zeigte sich (4R,5S)/(4S,5R)-N-Ethyl-4,5-bis(2-chlor-4-hydroxy­phenyl)-2-imi­da­zolin (53) (EC50: MCF-7-2a-Zellen = 11 nM; ERα = 0.42 nM; ERβ = 3.1 nM). Ihre 7‑fach höhere Wirk­sam­keit an ERα kann in gerin­geren steri­schen Behinderungen in der etwas größeren LBD be­grün­det liegen. Im Vergleich zu 53 lag die Wirkung von E2 nur - abhängig vom Test­system - zwischen dem Faktor 240 und 310 höher. 4,5-Diaryl-2-imidazoline mit basischer Seitenkette zeigten an der MCF-7-2a- Zell­linie weder ago­nis­ti­sche noch anta­go­nis­tische Eigenschaften. An den ER-Sub­typen dage­gen kam es zu unterschiedlich starker Reduktion der agonisti­schen Eigen­schaften. Deri­vate mit zusätzlicher Ethylgruppe an C-2 zeigten schließ­lich auch anta­go­nis­tische Wir­kungen. (4R,5S)/(4S,5R)-2-Ethyl-4-(4-(2-pi­pe­ri­din-1-yl- ethoxy)­phe­nyl)-5-(4-hydroxy­phenyl)-2-imidazolin (49) zeigte an ERα nur anta­gonistische Effekte (ERα: IC50 = 62 nM), während an ERβ noch ago­ni­sti­sche Aktivität festgestellt wurde (ERβ: EC50 = 510 nM; IC50 = 8000 nM). Durch die gewinkelte Strukturgeometrie musste für Typ-II-Estrogene ein zu E2 unter­schied­liches Bin­dungs­modell an­ge­nom­men werden. Ihre Strukturanalogie zu SERM ließ ver­muten, dass der zweite Arylrest den b-Kanal in der LBD besetzt.

Estrogens mediated their effects via the estrogen receptor (ER) - a ligand- induced tran­scriptio­nal factor. Since 1996 two receptor subtypes (ERα and ERβ) are known. They show different dis­tri­bution patterns within human organism and influence each other. Besides female repro­duc­tion they regulate proliferation and differentiation of cells within both man and woman. Additional to the physiological ligand estradiol (E2) other steroidal and numerous non-steroidal compounds exert agonistic and antagonistic effects on ERαand ERβ. In order to complete the test system with ERα-depending MCF-7-2a- cells, new ER-subtype se­lec­tive trans­activation assays based on transient transfection of genuine ER-negative U-2OS-cells were established. The test systems with U-2OS-cells turned out to be the more sensitive assays for agonists and antagonists by comparison with MCF-7-2a-cells. Different compounds bearing the 1,2-diarylethane moiety derived from Hexestrol have been assayed on the ER. Para-hydroxy groups in both aryl residues proofed to be essential for estro­genic activity. Compounds with additional hydrophobic residues such as azido groups or a di­iodo­pla­tinum unit mediated estrogenic effects in spite of para-methoxy group. Throughout all classes of compounds (R,S)/(S,R)‑con­fi­gu­ration of the 1,2-diarylethane moiety showed better effects than the diastereomeric compounds. Non-cyclic 1,2-diazido- and 1,2-diamino-1,2-diarylethanes show structural similarity to E2. It is the reason why they were classified as type-I-estrogens and their binding mode to the ER was assumed to be analogous to E2. (1R,2S)/(1S,2R)-1,2-Diamino-1-(2,6-dichloro-4-hydroxy­phe­nyl)-2-(2-chloro-4-hy­droxy­phenyl)ethane (21 a) showed a 10-time higher potency on ERα than on ERβ (EC50: ERα = 2.8 nM; ERβ = 31 nM). This might be based on sterically hindrances between one amino group and the side chain of Met336 in ERβ. Depending on the basic structure (R,S)/(S,R)-configurated cyclic type-II-estro­gens showed different estrogenic activity. Besides [1,2-diamino-1,2-di­aryl­ethane]­Pt(II) complexes - the proto­type of type-II-estrogens - 4,5-diaryl-2-imidazolines exerted efficient estrogenic activity. Estro­genic potency of 2-imidazolines was enhanced by increasing their lipophilic character. With the num­ber of chlorine atoms in the aryl residues, N-alkylation and partly N,N -di­al­kylation estro­genic potency improved. However C-2-alkylation caused a decrease of estrogenic response. The most potent compound in this study was (4R,5S)/(4S,5R)-N-ethyl-4,5-bis(2-chlor-4-hydroxy­phenyl)-2-imi­da­zoline (53) (EC50: MCF-7-2a-cells = 11 nM; ERα = 0.42 nM; ERβ = 3.1 nM). Its 7-time higher potency on ERα might be caused by less sterically hindrances in the slightly lager LBD. Depending on the test system, E2 was only 240- to 310-time more active compared to 53. Derivatives of 4,5-diaryl-2-imidazolines with basic side chains showed neither agonistic nor anta­gonistic effects. On the ER- subtypes a different reduction of agonistic activity was achieved. At last antagonistic effects were seen by deri­vatives with an additional C-2-ethyl group. (4R,5S)/(4S,5R)-2-Ethyl-4-(4-(2-pi­pe­ri­di­ne-1-yl­ethoxy)­phe­nyl)-5-(4-hydroxy­phenyl)-2-imi­da­zo­line (49) showed only anta­gonistic effects on ERα (ERα: IC50 = 62 nM) whereas on ERβ ago­nistic activity was still established (ERβ: EC50 = 510 nM; IC50 = 8000 nM). According to their different spatial struc­ture to E2 a different binding mode was assigned to type-II-estrogens. Due to their struc­tu­ral analogy to SERM the second aryl residues was supposed to occupy the b-canal of the LBD.