Identification and Characterization of Legionella pneumophila Phospholipases A and their Role in Virulence

Abstract

Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaire s disease, a potentially fatal pneumonia. The bacterium possesses secreted and cell- associated lipolytic activities, in particular phospholipase A (PLA) activity. Bacterial phospholipases are potential virulence factors as they facilitate lysis of host cell membranes and interference with host signal transduction pathways by the release of second messengers. Since the proteins responsible for the PLA activity were still unknown, it was of particular interest to identify them and investigate their role during L. pneumophila infection. In the present investigation seven proteins were identified as PLA candidate proteins either by screening the L. pneumophila genomic database for proteins with lipase motifs or by protein purification followed by N-terminal sequencing. These new proteins were designated as follows: PlaB, PlaC, PlaD, PatA, Unk1, LvrE, and Aas. The analysis of corresponding L. pneumophila mutants and expression of the corresponding genes in Escherichia coli revealed that five of the seven proteins indeed possessed phospholipase A and lysophospholipase A activities. These five proteins, PlaB, PlaC, PlaD, PatA, and Aas, belong to four different groups of lipolytic enzymes. PlaB displays a modified lipase motif, PlaC and PlaD belong to the family of GDSL hydrolases, PatA is one of eleven L. pneumophila Philadelphia-1 proteins with a patatin domain, and Aas belongs to the group of 2-acylglycerophospholipid acyltransferases. The virulence of the L. pneumophila plaC, plaD, patA, and aas mutants was assayed in infection models.

Legionella pneumophila ist der Erreger der Legionärskrankheit, welche eine Lungenentzündung mit gegebenenfalls tödlichem Ausgang darstellt. Das Bakterium besitzt sekretierte und zellassoziierte lipolytische Aktivitäten, insbesondere Phospholipase A Aktivitäten. Bakterielle Phospholipasen sind potentielle Virulenzfaktoren, da sie in der Lage sind, Wirtsmembrane zu lysieren und durch die Freisetzung von sekundären Botenstoffen in die Signaltransduktionswege der Wirtszelle einzugreifen. Durch das Screenen der L. pneumophila Genomdatenbank nach kodierten Proteinen mit einem Lipasemotif sowie durch eine Proteinaufreinigung wurden sieben Proteine indentifiziert, die als mögliche Phospholipasen A in Fragen kamen und näher untersucht wurden. Diese Proteine wurden wie folgt bezeichnet: PlaB, PlaC, PlaD, PatA, Unk1, LvrE und Aas. Eine Untersuchung der entsprechenden L. pneumophila knockout Mutanten sowie die Expression der entsprechenden Gene in Escherichia coli zeigte, dass fünf dieser sieben Proteine tatsächlich Phospholipase A Aktivität besaßen. Diese fünf Proteine, PlaB, PlaC, PlaD, PatA und Aas können vier verschiedenen Lipaseuntergruppen zugeordnet werden. Die PlaB Sequenz zeigt ein modifiziertes Lipasemotif, PlaC und PlaD gehören zu den GDSL Hydrolasen, PatA ist eines von elf L. pneumophila Proteinen mit einer Patatindomäne und Aas gehört zu den 2-Acylglycerophospholipid Acyltransferasen. Die Virulenz der L. pneumophila plaC, plaD, patA und aas Mutanten wurde in Infektionsmodellen untersucht.