Untersuchung von Sequenzalterationen des Vitamin-D-Rezeptor-Gens im Hinblick auf Hypocalcämie und Gebärparese bei Milchkühen

Abstract

Die peripartale Hypocalcämie der Milchkuh gehört zu den bedeutendsten Störungen des Mineralstoffwechsels in der Milchviehhaltung. In den USA wird das Auftreten von subklinischen Hypocalcämien bei Erstkalbinnen mit bis zu 25%, bei Vielkalbinnen mit 40 bis über 50% angegeben (Reinhardt et al. 2010), die Inzidenz für die Ausprägung klinischer Symptome wie Festliegen (Gebärparese) beträgt 5-10% (DeGaris und Lean 2008; Goff 2008). Daher sind vielfaltige Prophylaxe- und Therapiekonzepte inzwischen gängige Praxis in der Milchviehhaltung. Die Pathogenese der Hypocalcämie ist seit vielen Jahren bekannt. Der sprunghaft ansteigende Calcium-Bedarf für die Bildung von Kolostrum und Milch kann nicht schnell genug durch entsprechende Absorption aus dem Magen-Darm-Trakt bzw. Mobilisation aus dem Knochen gedeckt werden. Fällt der Blut-Calcium-Spiegel unter einen Schwellenwert, kommt es zum klinischen Bild des Festliegens. Die Regulation des Calcium-Haushalts ist zwar vielfach und in der Sequenz der Regulationsabläufe auch bei Kühen beschrieben worden, unklar ist jedoch immer noch, warum einige Tiere die Umstellung auf den erhöhten Calcium-Bedarf ohne Ausprägung klinischer Symptome überwinden, andere hingegen nicht. Beim Menschen sind Polymorphismen des Vitamin-D -Rezeptor-Gens im Zusammenhang mit veränderter Knochendichte, Osteoporose und verändertem Calciumgehalt der Milch beschrieben worden. Da der Vitamin-D-Rezeptor (VDR) die Umsetzung der Wirkungen von Calcitriol, der biologisch aktiven Form des Vitamin D, vermittelt, ist er essentiell für den Erhalt der Calcium-Homöostase. Die beim Menschen nachgewiesenen Beziehungen zwischen Alterationen des VDR und Störungen des Calcium-Haushalts überraschen daher nicht. Polymorphismen im bovinen Vitamin-D-Rezeptor-Gen könnten somit möglicherweise eine Prädisposition für die Gebärparese bzw. die Resistenz erklären. Variationen in der Nukleinsäuresequenz der Exons können den Austausch von Aminosäuren und damit eine veränderte Proteinsequenz des Vitamin-D-Rezeptors verursachen, die wiederum eine veränderte Ansprechbarkeit des Rezeptors, beziehungsweise, je nach Lokalisation der Mutation, eine eingeschränkte Funktionalität der betroffenen Protein-Domäne bedingen kann. Sequenzen von VDR-Exons und angrenzenden Intron-Abschnitten von 26 Milchkühen, alle in der 4.-6. Laktation, wurden mit der auf NCBI veröffentlichten Sequenz verglichen. Vier der acht entdeckten Sequenzalterationen sind auf Exons lokalisiert. Bei Vergleich der veränderten Basensequenz mit den für Aminosäuren kodierenden Tripletts, wurden in allen vier Fällen potentielle Änderungen auf die Aminosäuresequenz festgestellt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte kein Zusammenhang zwischen gefundenen Variationen in Exon- oder exonnahen Intron-Bereichen des VDR-Gens und Hypocalcämie-Inzidenz bei Milchkühen festgestellt werden (p>0,05). Da nur ein begrenzter Teil des VDR- Gens sequenziert wurde, ist eine Hypocalcämie-bedingende Basen-Alteration nicht ausgeschlossen, eine Alteration mit direkten Auswirkungen auf das VDR- Protein erscheint aber unwahrscheinlich. Aus statistischen Gründen wäre in einer fortführenden Studie außerdem eine größere Fallzahl wünschenswert. Limitierender Faktor bei der Auswahl der Probanden aus einem Betrieb, sind jedoch Kühe in ihrer 4.-6. Laktation, aus ähnlichen Haltungsbedingungen, die noch nie mit einer Hypocalcämie auffällig geworden oder verwandt sind.

Periparturient hypocalcemia belongs to the most important mineral metabolism dysfunctions in dairy cows. The incidence of subclinical hypocalcemia in the USA is given with 25% in heifers and up to 40 to 50 % in older cows (Reinhardt et al. 2010), the incidence of clinical symptoms (downer cow syndrome) is given with 5-10% (DeGaris und Lean 2008; Goff 2008). Hence manifold prophylaxis and therapy concepts to prevent periparturient paresis are established in current practice in dairy cattle husbandry. The aetiopathology of hypocalcemia is well known for many years. The escalating need for calcium to produce colostrum and milk at the onset of lactation cannot be covered fast enough through absorption of calcium from the gastrointestinal tract or through mobilization from the bone. Clinical symptoms occur if the blood- calcium-level drops under a defined marginal value. The regulating steps to maintain calcium homeostasis have been described repeatedly, also in cattle, though it remains elusive why some animals are able to adjust to the increased calcium need without developing hypocalcemia, while others are not. In humans, correlations of vitamin D receptor gene polymorphisms with lower bone density, osteoporosis and varying calcium concentration in breast milk have been reported. Because the vitamin D receptor (VDR) moderates the effects of 1,25(OH)2D3, the biologically active form of vitamin D, in the cells, it is a key factor for maintaining calcium homeostasis. Hence, proven relations between VDR alterations and disturbances in calcium balance in humans do not surprise. Alterations of the bovine VDR gene could possibly explain a predisposition for periparturient paresis or resistance of the VDR. Variations of the nucleic acid sequence can cause a replacement of amino acids and subsequent an altered protein sequence of the vitamin D receptor, that can be etiological for a modified responsiveness of the receptor or cause an altered functionality of the VDR protein, according to the domain where the mutation is located. Sequenced VDR exons and adjacent intronic parts of 26 dairy cows, all in their 4th to 6th lactation, were compared to the published sequence on NCBI (NC_007303.4). Four out of eight discovered alterations were localized on exons. When the modified base sequence was compared to the triplets coding for amino acids, a potential change of the amino acid sequence could be detected in all of the four cases. Nevertheless, no correlation could be observed between located variations and hypocalcemia incidence in tested dairy cows (p>0.05). Because only a limited part of the VDR gene has been sequenced for this project, a VDR gene sequence alteration causing hypocalcemia cannot be obviated, though an alteration with direct effects on the VDR protein seems improbable. For statistical reasons a greater number of animals would be preferable in a continuing study, though limitating factor in choosing probands is to find dairy cows in their 4th to 6th lactation with similar living conditions that have never experienced hypocalcemia before.