An efficient method for random mutagenesis in Mycobacterium avium subsp. hominissuis and for screening of mutants affected in virulence

Abstract

The genus Mycobacterium (M.) comprises highly pathogenic bacteria such as M. tuberculosis as well as environmental opportunistic bacteria called non tuberculous mycobacteria (NTM). While the incidence of tuberculosis is declining in the developed world, infection rates by NTM are increasing. NTM are ubiquitous and have been isolated from soil, natural water sources, tap water, biofilms, aerosols, dust and sawdust. Lung infections as well as lymphadenitis are most often caused by M. avium, which is considered to be among the clinically most important NTM. Only few virulence genes from M. avium have been defined due to difficulties in generating site-directed M. avium mutants. More efforts in developing new methods for mutagenesis of M. avium and identification of virulence-associated genes are therefore needed. A random mutagenesis method was developed based on illegitimate recombination and integration of a hygromycin resistance marker. Screening for mutations possibly affecting virulence was performed by monitoring of low pH resistance, colony morphology, cytokine induction in infected macrophages and intracellular persistence. Out of 50 randomly chosen hygromycin resistant colonies, four revealed to be affected in virulence-related traits. The mutated genes were MAV_4334 (nitroreductase family protein), MAV_5106 (phosphoenolpyruvate carboxykinase), MAV_1778 (GTP-binding protein LepA) and MAV_3128 (lysyl-tRNA synthetase LysS). The complemented strain MAV3128Comp showed reversal of the mutant phenotype in selected phenotypic tests. This study proposes a well-functioning method to randomly mutagenise M. avium by illegitimate recombination, genetically characterise the mutations to the nucleotide level and screen the mutants with simple phenotypic tests providing information about virulence-associated features. By this method, four M. avium genes were identified that may be involved in virulence.

Die Gattung Mycobacterium (M.) umfasst hochpathogene Spezies, wie beispielsweise M. tuberculosis, aber auch opportunistische Umwelterreger, die zu den nicht tuberkulösen Mykobakterien (NTM) gezählt werden. Während die Inzidenzraten für Tuberkulose in den Industrieländern zurückgehen, steigen die Infektionsraten durch NTM. Ubiquitäre NTM wie das in dieser Arbeit untersuchte M. avium wurden schon aus dem Erdreich, natürlichen Wasserquellen, Leitungswasser, Biofilmen, Aerosolen, Staub und Sägemehl isoliert. Die am häufigsten von M. avium verursachten Krankheiten sind Lungeninfektionen und Lymphadenitis, M. avium zählt in vielen Ländern zu dem am häufigsten aus Patienten isolierten NTM, weswegen dieser Spezies unter den NTM die größte klinische Bedeutung zugeschrieben wird. Aufgrund von Schwierigkeiten bei der gezielten Mutagenese wurden bisher nur wenige Virulenzgene von M. avium charakterisiert. Es ist daher notwendig, neue Methoden zur Mutagenese und Identifizierung weiterer Virulenzgene zu entwickeln. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine neue Methode der Zufallsmutagenese, basierend auf illegitimer Rekombination und Integration eines Hygromycinresistenzmarkers entwickelt. Die anschließende Identifizierung möglicher, die Virulenz beeinflussender Mutationen, erfolgte anhand von Untersuchungen zur Resistenz gegenüber niedrigem pH-Wert, zur Koloniemorphologie, zur Amöben-Resistenz, zur Induktion der Zytokinsynthese infizierter Makrophagen sowie zum intrazellulärem Überleben in infizierten Makrophagen. Von 50 zufällig ausgewählten, hygromycinresistenten Kolonien, waren vier in virulenzassoziierten Eigenschaften verändert. Die mutagenisierten Gene waren MAV_4334 (Proteinfamilie der Nitroreduktasen), MAV_5106 (Phosphoenolpyruvat- Carboxykinase), MAV_1778 (GTP-bindendes Protein LepA) und MAV_3128 (Lysyl-tRNA Synthetase LysS). Der komplementierte Stamm MAV3128Comp zeigte in ausgewählten phänotypischen Tests eine Reversion des durch die Mutation in dem Gen MAV_3128 verursachten Phänotyps. Diese Studie beschreibt eine für M. avium gut funktionierende Methode der Zufallsmutagenese, der molekularen Charakterisierung der Mutanten und des phänotypischen Screenings zur Identifizierung von Mutanten, die in virulenzassoziierten Eigenschaften verändert sind. Mit Hilfe dieser Methode wurden vier Gene bei M. avium identifiziert, die an der Virulenz beteiligt sein könnten.