Opioids in neuropathic pain - the role of potassium channels in peripheral sensory neurons

Abstract

Neuropathic pain is a debilitating condition often arising from damage to peripheral nerves.Patients suffer from spontaneous pain and pain evoked by thermal / mechanical stimuli. The underlying pathophysiology is complex and poorly understood. Opioids are powerful analgesics; however, their use is limited by centrally mediated side effects like respiratory depression and addiction. Activation of opioid receptors in peripheral sensory neurons is devoid of adverse centrally induced effects and can ameliorate neuropathic pain in animal models.Mechanisms of peripheral opioid analgesia have therefore gained interest in pain research. Among the proposed mediators are G protein- coupled inwardly-rectifying potassium (Kir3) channels. However, conflicting evidence has been presented on Kir3 channel contribution to peripheral opioid analgesia. The goal of this study was to investigate changes in opioid mediated potassium conductance upon peripheral nerve injury in mice. We hypothesized that a lesion to a peripheral nerve results in enhanced opioid- induced potassium conductance through Kir3 channels in the corresponding sensory neurons. To mimic neuropathic pain, a chronic constriction injury (CCI) was used. To examine the effects of CCI on potassium channel conductance mediated by the selective μ-opioid receptor agonist [D-Ala2, N-MePhe4, Gly- ol]-enkephalin (DAMGO), potassium imaging and patch clamp were employed. Recordings were carried out in cultured dorsal root ganglia (DRG) neurons from mice without (naïve) and with CCI. For verification, similar experiments were performed in transfected human embryonic kidney (HEK) 293 cells. Using patch clamp, I successfully measured DAMGO-induced potassium currents, reversible by barium chloride, in μ-opioid receptor and Kir3.2 expressing HEK 293 cells as well as in DRG neurons from naïve and CCI mice. Contrary to our assumption, the DAMGO-induced potassium currents were significantly smaller in neurons from CCI mice compared to naïve mice. However, CCI did not change the rate of DAMGO-responders compared to naïve neurons. Potassium imaging experiments in HEK 293 cells and mouse DRG neurons did not provide conclusive data and raised methodological concerns regarding reliability and validity of the assay. These results confirm the opening of potassium channels by DAMGO in DRG neurons of naïve and CCI mice. They don’t support the hypothesis that CCI results in enhanced Kir channel conductance upon application of DAMGO in DRG neurons, but rather show a tendency towards smaller currents after CCI. This thesis provides new insight into the interaction of potassium channels and opioid receptors on murine peripheral sensory neurons in health and neuropathy, and important methodological considerations for further investigations into the site-specific contributions of potassium channels to peripheral opioid analgesia in neuropathic pain.

Neuropathische Schmerzen sind beeinträchtigende Veränderungen der Sensibilität, welche oft durch Läsionen peripherer Nerven verursacht werden. Patienten leiden u.a. an Spontanschmerz und Schmerz durch Temperatur- und Berührungsreize. Die zugrundeliegende Pathophysiologie ist komplex und wenig verstanden. Opioide sind wirkungsvolle Schmerzmittel, deren Einsatz jedoch durch zentralnervöse Nebenwirkungen wie Atemdepression und Abhängigkeit limitiert ist. Die Aktivierung von Opioidrezeptoren auf peripheren sensorischen Neuronen ist frei von diesen Nebenwirkungen und lindert neuropathische Schmerzen in Tiermodellen. Mechanismen peripherer Opioidanalgesie erfahren daher vermehrtes Interesse in der Schmerzforschung. Zu den vorgeschlagenen Mediatoren peripherer Opioidanalgesie gehören G -Protein-gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir3). Die Studienlage bezüglich der Rolle von Kir3 in peripherer Opioidanalgesie bei neuropathischen Schmerzen ist bislang jedoch nicht eindeutig. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, Veränderungen der opioidinduzierten Kaliumleitfähigkeit nach peripherer Nervenläsion bei Mäusen zu untersuchen. Wir nahmen an, dass die Läsion eines peripheren Nerven eine gesteigerte opioidinduzierten Kaliumleitfähigkeit durch Kir3 Kanäle in den entsprechenden Neuronen zur Folge hat. Als Modell für neurophatischen Schmerz verwendeten wir eine chronic constriction injury (CCI). Die Wirkungen der CCI auf die durch den μ-Opioidrezeptoragonisten [D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) ausgelöste Kaliumleitfähigkeit untersuchten wir in kultivierten Neuronen aus Spinalganglien von Mäusen mit und ohne CCI mit Hilfe von Potassium Imaging und Patch Clamp. Zusätzlich verwendeten wir transfizierte human embryonic kidney (HEK) 293 Zellen. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden konnte ich erfolgreich DAMGO-induzierbare Kaliumströme in MOR und Kir3.2 exprimierenden HEK 293 Zellen sowie peripheren Neuronen von Mäusen mit und ohne CCI messen, welche durch BaCl2 reversibel waren. Im Gegensatz zu unserer Hypothese waren die gemessenen Kaliumströme in CCI-Neuronen kleiner als in Neuronen naiver Mäuse. CCI veränderte jedoch die Rate der DAMGO-Antworten verglichen mit der naiven Gruppe nicht. Die Potassium-Imaging-Experimente an HEK 293 Zellen und Maus-Neuronen erbrachten keine schlüssigen Ergebnisse und warfen Fragen bezüglich Reliabilität und Validität des verwendeten Assays auf. Diese Ergebnisse bestätigen die Öffnung von Kaliumkanälen durch DAMGO in primären afferenten Neuronen von naiven Mäusen und Mäusen nach CCI. Die Hypothese, dass CCI zu erhöhter DAMGO-induzierbarer Leitfähigkeit von Kir3-Kanälen in primären afferenten Neuronen führt, wurde nicht bestätigt. Die reduzierte Opioidwirkung auf Kaliumströme nach CCI könnte auf Umverteilung von Kaliumkanälen und/oder μ-Opioidrezeptoren von Zellkörpern peripherer Neurone hin zum Ort des CCI am Axon hinweisen. Die vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse zur Interaktion von Opioidrezeptoren und Kaliumkanälen in peripheren Neuronen der Maus in Gesundheit und unter Neuropathie sowie wertvolle methodologische Hinweise für weitere Untersuchungen der Rolle subzellulärer Lokalisation von Kaliumkanälen für Opioidanalgesie bei neuropathischen Schmerzen.