Herstellung, Aufreinigung und Charakterisierung von polyklonalen Antikörpern gegen die β1- und β2-Untereinheit von BK Kaliumkanälen

Abstract

β-Untereinheiten tragen maßgeblich zur Funktionalität und Vielfalt spannungsabhängiger Ca2+-aktivierbarer BK Kaliumkanäle in verschiedenen Geweben bei. Durch die Modulation der physiologischen und pharmakologischen Eigenschaften ermöglichen sie eine vielfältige Integration in diverse Signalkaskaden. Die Funktion der beiden Untereinheiten BKβ1 und BKβ2 ist elektrophysiologisch beschrieben, aber noch unzureichend verstanden. Ihre Lokalisation im Gehirn ist bisher im Detail noch nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit ist deshalb die Untersuchung der genauen Lokalisation von BKβ1 und BKβ2 im Gehirn der Ratte mit immunzytochemischen Methoden. Perspektivisch soll damit der Grundstein für neue pharmakotherapeutische Möglichkeiten gelegt, sowie zum Verständnis der Rolle von BK Kaliumkanälen bei (patho-) physiologischen Vorgängen beigetragen werden. Ein für die gesamte extrazelluläre Schleife der Untereinheiten BKβ1 und BKβ2 kodierender cDNA- Abschnitt wurde mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und in die Expressionsvektoren pGEX-4T-1 und pET32b(+) kloniert. Nach Transformation in E. coli Bakterien erfolgte eine Überexpression der Proteine als entsprechendes Glutathion-S-Transferase- bzw. Thioredoxin-Fusionsprotein. Die Fusionsproteine wurden aufgereinigt und die GST-Fusionsproteine zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die nach etwa 100 Immunisierungstagen gewonnenen Rohseren wurden dekomplementiert und die IgG-Komponente unter Entfernung der IgM-Komponente und unspezifischer gegen Extrazellulärmatrix und Kollagenfasern gerichteter Antikörper, angereichert. Die Kreuzreaktivität der Antiseren gegen das Trägerprotein, sowie gegen paraloge BKβ-Untereinheiten wurde entfernt und anschließend eine Affinitätsreinigung durchgeführt. Das Resultat waren polyklonale, monospezifische Antikörper gegen den extrazellulären Anteil der Proteine BKβ1 und BKβ2, deren Spezifität mittels Western Blot Analysen und ELISA Techniken charakterisiert wurde. Die immunzytochemischen Untersuchungen zeigten eine Expression von BKβ1 im Hypothalamus, Hippocampus, Neocortex, in der medialen Habenula, sowie in unterschiedlichen Gliazellen. Eine Expression von BKβ2 konnte unter anderem im Hippocampus, im Neocortex und im Subkommisuralorgan detektiert werden. Die deutliche Expression von BKβ1 in Somata neuroendokrin aktiver Zellgruppen des Hypothalamus, besonders im Ncl. supraopticus, Ncl. paraventricularis hypothalami und Ncl. arcuatus, legt eine Beteiligung an der Modulation der Erregungsfrequenz und der damit zusammenhängenden Hormonausschüttung an der präsynaptischen Membran der Zelle nahe. Im Hippocampus werden BKβ1 und BKβ2 hauptsächlich in den Somata von Pyramiden- und Körnerzellen exprimiert. Es ist nahe liegend, dass beide Proteine an der Regulation eingehender erregender Salven beteiligt sind. Sie erhöhen die Ca2+-Sensitivität des BK Kaliumkanals und ermöglichen der Zelle sehr differenziert auf Änderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration sowie des Membranpotentials zu reagieren. Zusätzlich konnte BKβ1 auch in der Moosfaserzone nachgewiesen werden, und ist dort möglicherweise an der Transmitterausschüttung beteiligt.

Large conductance Ca2+-activated BK channels are important regulators of action potential duration and firing frequency in many neurons. As the pore- forming subunits of BK channels are encoded by a single gene, channel diversity is mainly generated by alternative splicing and interaction with auxiliary beta-subunits (BKbeta1-4). In hypothalamic and hippocampal neurons BK channels have been described electrophysiologically; however, the distribution of BKbeta subunits is unknown so far. Therefore, antibodies against the large extracellular loop of the BKbeta1 and BKbeta2 subunits were raised, freed from cross-reactivity against paralogous BKbeta subunits and affinity-purified. The resulting polyclonal monospecific BKbeta1 and BKbeta2 antibodies were characterized by Western blot analysis and ELISA techniques. Regional and cellular distribution in rat brain tissue was analysed by immunocytochemistry, where the expression of BKbeta1 in rat hypothalamic neurons and the expresseion of BKbeta1 and BKbeta2 in rat hippocampal neurons were investigated. In both cases immunostaining was predominantly localized to somata, indicating strong expression of BKbeta1 and BKbeta2 in these areas.