Charakterisierung der CDPKs CPK21 & CPK23 aus Arabidopsis thaliana

Abstract

Calcium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) sind Ser/Thr Protein Kinasen, die stress-spezifische Änderungen cytoplasmatischer Calcium Konzentrationen erkennen und in definierte Phosphorylierungsmuster zur Signalweiterleitung übersetzten, worauf eine angemessene adaptive Antwort auf sich ständig verändernde Umweltbedingungen erfolgt. In dieser Doktorarbeit wurde die Rolle der beiden nahesten verwandten CDPKs CPK21 und CPK23 aus Arabidopsis thaliana innerhalb der Signaltransduktion von Salz- und hyperosmotischem Stress untersucht. Mittels phänotypischer Charakterisierung adulter Pflanzen der beiden T-DNA-Insertionslinien cpk21 (SALK_029412) und cpk23 (SALK_007958) wurden CPK21 und CPK23 als putative Negativregulatoren der Salzstressantwort identifiziert, die insbesondere eine Rolle in der Antwort auf die osmotische Komponente des Salzstresses spielen. Messungen des Natrium- und Kaliumgehaltes in den grünen Geweben von Col-0, cpk21 und cpk23 zeigten ein höheres K+/Na+-Verhältnis in cpk23 verglichen mit Col-0 nach eintägiger Exposition mit 100 mM NaCl. Auf RT-PCR basierende Expressionsstudien zeigten, dass die Expression von CPK21 als Antwort auf Salz- und hyperosmotischen Stress sowie ABA-Applikation aktiviert wird. CPK23 Transkriptakkumulation wurde als Antwort auf hyperosmotischen Stress sowie ABA-Applikation beobachtet. Auf eine Rolle von CPK21 in der Salzstressantwort weist auch die beobachtete biochemische in vivo Aktivierung des Enzyms nach Salz- und hyperosmotischem Stress, sowie nach ABA-Applikation hin. Zur weiteren biochemischen Charakterisierung von CPK21 wurde der Einfluss der Calciumbindung auf die Enzymaktivität untersucht. Dafür wurden verschiedene StrepII-markierte Versionen, in denen die Calciumbindung an eine (EF1, EF2, EF3 oder EF4) oder zwei EF-Hände (C-terminales oder N-terminales EF-Hand Paar) verhindert wurde, transient in N. benthamiana exprimiert. Nach Aufreingung dieser Enzymvarianten und anschließendem Kinasetest mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen konnte gezeigt werden, das die N-terminalen EF-Hände für die biochemische Aktivierung des Enzyms essentiell sind. In vergleichenden physiologischen Studien unter Verwendung von Col-0, den beiden T-DNA Insertionslinien cpk21 und cpk23 sowie cpk21 und cpk23, welche die generierten CPK21- und CPK23- Enzymvarianten unter Kontrolle des 35S-Promoters exprimierten, konnte gezeigt werden, dass die Enzymvarianten in Abhängigkeit ihrer in vitro Kinaseaktivität, unterschiedliche Fähigkeiten besaßen, den Mutantenphänotyp zu komplementieren. Damit konnte zum ersten Mal eine Korrelation zwischen Ca2+ - abhängiger in vitro Kinaseaktivität und in vivo Funktion für CDPKs gezeigt werden.

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are Ser/Thr protein kinases which perceive changes in cytoplasmic calcium concentrations and translate them into defined phosphorylation patterns for signaltransduction in a continuously changing environment. This PhD thesis addresses the role of the two closest homologs CPK21 and CPK23 from Arabidopsis thaliana in signaltransduction events upon salt - and hyperosmotic stress. Phenotypical characterisation of two T-DNA insertion lines cpk21 (SALK_029412) and cpk23 (SALK_007958) identified CPK21 and CPK23 as putative negative regulators in the salt stress response, with an unknown function in particular in response to the osmotic component of salt stress. Measurements of the sodium- and potassium content in green tissues of Col-0, cpk21 and cpk23 showed a higher K+/Na+-ratio in cpk23 compared to Col-0 after one day exposure to 100 mM NaCl. RT-PCR based expression studies showed an induction of CPK21 expression after salt – and hyperosmotic stress and ABA application. CPK23 transcript accumulation was observed in response to hyperosmotic stress and ABA application. The biochemical in vivo activation of CPK21 after ABA application, salt – and hyperosmotic stress additionally refers to a role of the enzyme in salt signaltransduction. For further biochemical characterisation of AtCPK21 the role of calcium binding for enzyme activity was investigated. Therefore different StrepII-tagged enzyme variants, with single mutations in all four EF-hands (EF1, EF2, EF3 oder EF4) and double mutations in either the C-terminal or N-terminal EF-hand pair, preventing calcium binding, were transiently expressed in N. benthamiana. After purification a kinase assay with different calcium concentrations was performed. It was shown that the N-terminal EF-hands were essential for biochemical activation of CPK21. Physiological studies using Col-0, the two T-DNA insertion lines cpk21 and cpk23 and cpk21 and cpk23, expressing the generated CPK21- and CPK23- enzyme variants under control of the 35S-promoter showed different abilities of the enzyme variants to complement the mutant phenotype dependent on their in vitro enzyme activity. This study showed for the first time a correlation between Ca2+ - dependent in vitro kinase activity and in vivo function for CDPKs.